七宝美髯颗粒、维血康咀嚼片等五种中成药中微生物限度检测方案(集菌仪)

2007年第1期49 50内蒙古中医药 ( 10]叶向荣，张素芬，张丹，等.艾灸神穴穴抗癌的实验研究 [].山东中医药大学学报，2000，24(32)：29. ) ( [1]桂金水，朱凌云，许鸣，等.艾灸抗小鼠肿瘤作用的实验 研究[].针灸学报，1990，6(8)：1. ) ( [12]金安德.针灸对免疫机能的调整功能[].针刺研究， 1986，11(4)：315. ) ( CDK4在食管癌中的表达及其意义[].癌症，2000，1 (19) ： 124. ) ( [14]邵荣光.以细胞周期调控分子为靶点的肿瘤治疗[].中 国肿瘤，2005，14(11)：706-708. ) ( 15]彭绍华，杨剑锋，谢平平，等.细胞周期蛋白在肝细胞癌组织中的表达及其与肿瘤细胞凋亡的关系.2005，24 (6)：695-698. ) Experimental study for the effect on moxibustion onrelative cell cycle control genes ：cyclind1 and cdk4 of HCCprecancerous lesion on big rats (Ao You- Guang ，Liu Dong- Xia， Yang Yun- Kuan，Zhai Wei ，Zhang Ying-Jun. The Traditional Chinese and Mongolia Medical College， Inner Mongolia Medical College ，Huhhot ，010020) Abstract ：Objective： To study the efiect of moxibustion in relative cell cycle control genes ，cyclinD1 and cdk4 ofHCC precancerous lesion on big rats. Method： 74 SD rats were randomly divided into groups：1. Blank controlgroup (20) ；2. Model group (27) ；3. Moxibustion group (27). The rats of model group received DEN until themodel were successfully established. The moxibustion group received Moxibustion on acupoint ZuSanLi from thefirst day. Immunohistochemistry methods were used to study the efiect of Moxibustion on relative cell cyclecontrol genes of cyclinD1 and cdk4 of HCC precancerous lesion on big rats. Results：Moxibustionhas obviouseffects on deereasing the excessive expression of CD K4 and CyclinD1. Conclusion ： It is possible that Moxibustioncould inhibit precancerous lesion. It'sefiect is relative to inhibiting the excessive expression of cell cycle controlgene ofCyclinD1 and CDK4. Key words ：moxibustion； Pepatocellular carcinoma ； Precancerous lesion cell cycle control 五种中成药微生物限度检查的方法验证 乙静平 刘炳茹*乙晓蒙 摘 要：目的：通过微生物限度检查的方法验证，确立五种中成药微生物限度检查方法。方法：采用常规法、培养基稀释法、离心集菌薄膜过滤法对五种中成药进行加菌回收并计算回收率。结果：确立了五种中成药的微生物限度检查方法。结论：七宝美髯颗粒细菌数用常规法；感冒清热颗粒、维血康咀嚼片细菌数用培养基稀释法；活血止痛散、山菊降压颗粒细菌数用离心集菌薄膜过滤法测定。五种药的霉菌数和酵母菌数均可采用常规法测定。 关键词：中成药；微生物限度检查；方法验证 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1006-0979(2007)01-0049-02 中成药是由多味药材组成的复方制剂，其中很多单味药材具有清热解毒、消痈消肿作用，即可能具有抑菌活性，那么对有抑菌作用的中成药按常规法做微生物限度检查，药品中污染的微生物生长可能被抑制，就会影响试验结果的可靠 ( *内蒙古药品检验所(010020) ) 性，所以对有抑菌作用的中成药做微生物限度检查时，必须采用适当的方法，对含抑菌成分的供试品消除抑菌活性后，微生物限度检查结果才能反映出药品的真实污染情况。要判断检查方法的正确性和可行性，必须对所采用的检验方法进行方法验证。我们对五种中成药的微生物限度检查按文献的规定，进行了方法验证，确立了各自可行的微生物限 度检查法，为以品种制定微生物限度标准提供了科学依据。 试验材料及仪器 1.1 仪器：HTY-2000集菌仪、反复使用集菌培养器(杭州泰林医疗器械有限公司)。 1.2 供试品：内蒙古包头制药有限公司、赤峰天奇制药有限公司提供。 1.3 试验菌株和培养基：大肠埃希菌[CMCC(B)44102]，金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]，枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]，白色念珠菌[CMCC(F)98001]，黑曲霉菌[CMCC(F)980031，试验中所用培养基由中药药品生物制品检定所提供。 1.4 试剂、稀释剂：PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠由本所配制。 2 试验部分 2.1 菌液制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基，35~37℃培养18~24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1mL含50~100cfu 的菌悬液。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23~28℃培养18~24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1mL 含 50~100cfu 的菌悬液。 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5~7天，使大量的孢子产生，加入3~5mL 的0.9%无菌氯化钠液，将孢子洗脱，吸出孢子菌液至灭菌试管内，将菌液稀释至1nL.含50~100cfu 的菌悬液。 2.2 供试液制备：取供试品10g，加稀释剂100mL，制成1：10 的供试液备用。 2.3 试验方法 2.3.1 常规法：采用1ml/皿的供试液，加入15~20ml琼脂培养基做菌落计数。 2.3.2 培养基稀释法：采用0.2ml/皿的供试液，加入15-20ml琼脂培养基做菌落计数。 2.3.3 离心集菌薄膜过滤法：取一定量的供试液(1：10)，500转/min 离心5分钟，取全部上清液，将规定量的供试液加入薄膜过滤器中，冲洗液 300ml/膜，过滤。取出滤膜，菌面朝上贴于相应的培养基平板上，做菌落计数。 2.4 回收率测定 2.4.1 试验组：取1：10的供试液各1mL，分别注两个平皿，加入50~100cfu 试验菌，立即注入45℃的溶化的琼脂培养基15~20mL ，摇匀，凝固后，将平板倒置于规定的温度培养至规定的时间，做菌落计数。 2.4.2 菌液组：测定所加的试验菌数。 2.4.3 供试品对照组：测定供试品本底菌数。 2.5 试验结果：结果判断若常规法实验组的菌回收率不低于70%，符合验证试验，可按此方法测定供试品的细菌数、霉菌及酵母菌；若任一次平行试验中试验组的菌回收率低于70%，不符合验证试验，应使用稀释法，重新验证；若任一次平行试验中稀释法试验组的菌回收率率于70%，不符合验证试验，应采用离心集菌薄膜过滤法，重新验证。 表1 五种中成药常规法(1ml/皿)各菌回收率 回 收率 () 药品名称 大肠 金黄色 枯草芽 白色 黑曲 埃希菌葡萄球菌孢杆菌 念珠菌 霉菌 七宝美髯颗粒 100 109 81 98 99 感冒清热颗粒 110 44 62 110 113 维血康咀嚼片 91 89 17 92 93 活血止痛散 75 4 0 96 89 山菊降压颗粒 105 63 0 94 91 表2 四种中成药培养基稀释法(0.2ml/皿)各菌回收率 药品名称 回 收：率 ：(%) 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌 感冒清热颗粒 113 98 85 维血康咀嚼片 98 94 76 活血止痛散 103 64 15 山菊降压颗粒 99 68 21 表3 两种中成药离心集菌薄膜过滤法各菌回收率 药品名称 回 收 率 (%) 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌 活血止痛散 96 73 95 山菊降压颗粒 86 86 84 从表1可见，只有七宝美髯颗粒各试验菌的回收率均高于70%，其它四种中成药对细菌均有不同程度的抑菌作用，有些试验菌的回收率达不到70%，改用培养基稀释法重新试验，但白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率均高于70%，说明不抑制霉菌，霉菌和酵母菌数的测定可用常规法；从表2可见，感冒清热颗粒、维血康咀嚼片各试验菌的回收率均高于70%，其它两种有些菌回收率仍低于70%，说明这些药抑菌作用较强，用培养基稀释法不能消除抑菌作用，再用离心集菌薄膜过滤法，重新验证；从表3可见，活血止痛散和山菊降压颗粒用离心集菌薄膜过滤法各试验菌的回收率均高于70%。 2.6 结 论 根据验证试验结果，确立了七宝美髯颗粒细菌数用常规法；感冒清热颗粒、维血康咀嚼片细菌数用培养基稀释法测定；活血止痛散、山菊降压颗粒用细菌数用离心集菌薄膜过滤法测定。五种中药的霉菌数和酵母菌数均可采用常规法测定。 3 讨 论 从试验结果可以看出，供试品进行微生物限度检查时必须进行方法验证，才可确保检验结果的准确、科学。因此，药品的微生物限度检查方法需经验证，以确定所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，验证合格后方可使用，以保证检验结果的可靠性。另外，当药物的生产方法变更、制剂组分发生改变、检查法修订或检验条件发生改变时，检查方法也应重新进行验证② ( 参考文献 ) ( 1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(2005年版一部)M].北京：化学工业出版社.2005：附录71. ) ( 2]许华玉，等.药品中微生物污染检测方法验证的必要性S].中国药品标准，2005.4(6). ) O China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net