β2内酰胺类抗生素中无菌检查检测方案(集菌仪)

江苏药学与临床研究 2004年第12卷第5期 酶处理与薄膜过滤联合应用于β-内酰胺类抗生素的无菌检查 钱文静 蔡美明 江苏省药品检验所 (南京 210008) 关键词：酶；薄膜过滤片；抗生素药；无菌检查 中图分类号 R915 文献标识码 A 文章编号 1007-306(2004)05-70-03 -内酰胺类抗生素指化学结构中具有β内酰胺环的一大类抗生素，具有较强的抗菌活性。以往对该类药物的无菌检查，是加入青霉素酶，破坏其化学结构中的β-内酰胺环，使其失去抗菌活性后再进行直接接种，以检出该制剂中可能污染的微生物。这种方法不仅需要大量的青霉素酶(酶的加入量约为青霉素单位的3~4倍)【1]，而且不易灭活彻底，容易污染。2000年版《中国药典》对该类药物无菌检查规定亦可用薄膜过滤法[2]。在实际工作中，薄膜过滤法必须用大量的冲洗液才能除去抗菌成分，使阳性对照菌正常生长。大量的冲洗，不仅影响滤膜的孔径，使截留在膜上的细菌滤过，而且还使污染的细菌受到损伤，从而降低阳性检出率，影响实验结果的准确性。为了解决这一矛盾，根据我国药典要求，对该类12个品种、24批样品采用酶处理与薄膜过滤结合的方法进行无菌检查，不但减少酶和冲洗液的用量，降低成本，提高工作效率，还提高了阳性检出率。尤其用0.1%蛋白胨溶液冲洗，效果更佳。现就此方法在β-内酰胺类抗生素中的应用作一推介。 1 实验材料 1.1 仪 器 HTY全封闭无菌检测系统(集菌仪为HTY2000A型；一次性使用全封闭集菌培养器为KDGB-330型，供瓶装抗生素粉剂使用；均为杭州泰林医疗器械厂生产)。 1.2 菌 种 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)260031为中国药品生物制品检定所提供。用前取金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基中，在30℃~35 ℃培养18~24h后，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升含菌10~100菌落形成单位(cfu)的菌悬液。 1.3 培养基 硫乙醇酸盐液体培养基、营养琼脂培养基、肉汤培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基，均由中国药品生物制品检定所提供。 1.4 试 剂 青霉素酶装量：2ml，>300 万单位/ml，用于无菌检查，每毫升可水解青霉素80万单位，为中国药品生物制品检定所提供。 2 实验部分 2.1 实验方法 2.1.1 实验方法I31 按《中国药典》2000年版二部 附录XI H无菌检查法项下薄膜过滤法操作。取供试品6瓶或原料6份，各0.5g，平均分成3组，每组2瓶或原料1克，分别用0.9%无菌氯化钠溶液(或0.1%蛋白胨水溶液)100ml溶解，过滤于三联式的全封闭过滤器(DGB-330)的一个筒内，共得均匀的3筒。每筒先用0.9%无菌氯化钠溶液(或0.1%蛋白胨水溶液)少量多次地(50ml ×3次)中洗滤筒、滤膜，3筒共计用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗450ml。抽干滤膜，用灭菌注射器抽取取霉素酶1支(2ml/支)，注入含150 ml 0.9%无菌氯化钠溶液(或0.1%蛋白胨水溶液)的瓶中，摇匀，平均抽注于3筒中，每筒50 ml，保留酶溶液。轻轻晃动滤筒内酶溶液，使充分接触滤筒内壁和滤膜，使酶与残留的β内酰胺类抗生素作用，分别放置5、15、30 min 后。抽干酶溶液，每筒注入液体硫乙醇酸盐培养基100 ml，再分别加入10~100个金黄色葡萄球菌，置35℃±1℃培养。每个品种平行实验3次，同时做不加酶处理的对照组实验。记录24~48h阳性菌生长情况。 2.1.2 实验方法Ⅱ3] 取供试品6瓶或原料6份，各0.5g，加入0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜溶剂至少150ml，混合后，于三联式的全封闭过滤器(DGB-330)过滤，然后用含酶的0.9%无菌氯化钠溶液(取0.9%无菌氯化钠溶液450ml，注入酶2ml)， 少量多次地(150ml ×3次)冲洗滤器、滤膜。抽干冲洗液后，每个滤器注入硫乙醇酸盐培养基100ml(加入酶约0.7ml)。再分别加入10~100个金黄色葡萄球菌，置35 ℃±11℃培养。每个品种平行实验3次，同时做不加酶处理的对照组实验。记录24~48h阳性菌生长情况。 2.2 结果统计 2.2.1 第I种实验法结果 用第I种方法对8个品 种共23批样品进行了实验。用0.9%无菌氯化钠溶液和0.1%蛋白胨液冲洗，放置5 min，阳性对照均不生长，说明酶与残留的β-内酰胺类抗生素作用时间太短。放置15 min 和30 min ，两种溶液冲洗，其阳性对照在24~48h均能生长(用0.1%蛋白胨溶液冲洗阳性对照菌大多在24h生长)。为了缩短实验时间，提高工作效率，可选择放置 15 min ，用0.1%蛋白胨溶液冲洗。结果见表1。 表1 酶处理法不同放置时间阳性对照菌24~48h生长情况(n=3) 0.9%无菌氯化钠溶液冲洗 0.1%蛋白胨溶液冲洗 对照组 品 名 (min) (min) (不加酶) 5 15 30 5 15 30 注射用头孢哌酮钠 - + - - 注射用头孢他定 - + - + 十 - 注射用头孢拉定 + - + + - 注射用头孢曲松钠 - + 十 - + + - 注射用氨苄西林钠 - + + - + 一+ - 注射用头孢噻肟钠 - + + - + + - 注射用阿莫西林钠 - + - 十 十 - 注射用青霉素钠(n=2) - + 一 + + - 2.2.2 第Ⅱ种实验法结果月用第Ⅱ种方法对12个品种共23批样品进行了实验。分别用0.9%无菌氯化钠溶液和0.1%蛋白胨溶液进行了稀释和冲洗比较，用0.1%蛋白胨溶液冲洗阳性对照大多在24h生 长，而用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗阳性对照在24~48h也能生长，符合《中国药典》的要求，而未加酶处理的实验对照组阳性对照经24~48h均不生长，说明酶处理法中第I种方法也是可行的。结果见表2。 表2β内酰胺类抗生素无菌检查中酶处理第Ⅱ种实验方法阳性对照24~48h生长情况 品名 批号 规格 生产厂家 实验方法Ⅱ 对照 0.9%无菌氯化钠溶液0.1%蛋白胨溶液 实验 注射用头孢哌 0210036 1.0 g 苏州东瑞制药有限公司 十 酮钠舒巴坦钠 030406 0.5 g 苏州第二制药厂 ++ 注射用 030203 1.5g 苏州东瑞制药有限公司 + 头孢哌酮钠 030204 3.0g 苏州东瑞制药有限公司 + 注射用 030507 1.5 g 苏州第二制药厂 + 头孢他定 030811002 0.5 g 苏州东瑞制药有限公司 + 注射用 030402 2.0 g 苏州东瑞制药有限公司 + 头孢拉定 030403 2.0 g 苏州东瑞制药有限公司 + + 注射用 030302 1.0 g 江苏华源药业有限公司 + + 头孢噻肟钠 030303 1.0g 江苏华源药业有限公司 十 头孢唑林钠 030447 0.5 g 上海先锋药业有限公司 + + 030448 0.5 g 上海先锋药业有限公司 十 + 注射用 030506 0.5 g 苏州东瑞制药有限公司 + + 头孢曲松钠 030601 0.5 g 苏州第二制药厂 注射用 020805 0.5 g 苏州第二制药厂 + 氨苄西林钠 020806 0.5 g 苏州第二制药厂 十 + 注射用氨苄西林 030402 1.0 g 苏州第二制药厂 + + 钠氨唑西钠 030403 1.0g 苏州第二制药厂 + 注射用阿莫西 C0304020 1.5 g 哈药集团制药总厂 + + 林舒巴坦钠 030701 0.75 g 苏州二叶制药有限公司 + + 注射用 030601 1.5g 苏州第二制药厂 十 ++ 阿莫西林钠 030602 1.5g 苏州第二制药厂 2.3 方法的验证 2.3.1 验证方法I(细菌回收率的测定) 将10~100cfu金黄色葡萄球菌(通过计数即得理论菌数)分别加入到0.9%无菌氯化钠溶液和0.1%蛋白胨溶液中，摇匀，各制备2份，通过薄膜过滤后，分别用 0.9%无菌氯化钠溶液和0.1%蛋白胨溶液冲洗滤膜，其中各1份分别加入1支酶，另1份不加酶，作为空白对照。抽干滤液取出滤膜，分别贴于预先置并经培养为阴性的营养琼脂平板上，经30℃~35℃培养48h，计数。结果见表3。 表3细菌回收率测定的结果(n=5) 1 2 3 4 5 平均 平均 回收率(%) 理论菌数 63 58 55 67 46 57.8 实验组 0.9%无菌氯化钠溶液 55 53 54 61 42 53 91.7 (加酶) 0.1%蛋白胨溶液 60 52 50 65 43 54 93.4 对照组 0.9%无菌氯化钠溶液 57 55 53 62 40 53.4 92.4 (不加酶) 0.1%蛋白胨溶液 62 57 49 60 45 54.6 94.5 由表3可见，加酶的实验组与不加酶的对照组细菌回收率基本是一致的，表明酶处理法可用于β内酰胺类抗生素的无菌检查，且无论是加酶组还是不加酶组，用0.1%蛋白胨溶液稀释和冲洗要比用0.9%无菌氯化钠溶液稀释和冲洗，其细菌回收率要稍高，故提倡用0.1%蛋白胨溶液作为稀释冲洗剂，以便提高阳性检出率，而且0.1%蛋白胨溶液是2005版《中国药典》附录无菌检查法项下收载的稀释冲洗液之一，0.9%氯化钠溶液已不被采用。 2.3.2 验证方法Ⅱ 将金黄色葡萄球菌10~100cfu分别加入到4份50ml 硫乙醇酸盐液体培养基中，其中3份分别加入酶0.7、1、2ml，另一份不加酶作为对照组。于30℃~35 ℃培养24~48h，取培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板上，置36 ℃±1进行分离培养，检查是否有典型的金黄色葡萄球菌生长。结果见表4。 由表4可见，在硫乙醇酸盐液体培养基中加入0.7~2ml的酶，培养24h均可见典型的金黄色葡萄球菌生长，证明青霉素酶对细菌的生长没有抑制作用。实验方法Ⅱ与实验方法Ⅰ同样均可用于β-内酰胺类抗生素的无菌检查，从提高工作效率角度出发，方法Ⅱ优于方法I。 表4 不同加酶量阳性菌的生长情况(n=5) 0.7ml* 1ml* 2ml 对照组* 24h 48h 24h 48h 24 h 48h 24h 48 h 2 3 + + + 4 + + + 5 + + *20h可见增菌培养基浑浊，分离培养(+)。 3 小 结 在β内酰胺类抗生素的无菌检查过程中，酶处理与薄膜过滤法联合应用能够减少冲洗液与酶的用量，简化实验步骤，提高工作效率(尤其是方法II)还能提高阳性检出率，保证无菌实验结果的可信度。对于稀释剂和冲洗剂的选择，首选0.1%蛋白胨溶液，以便与国外药典接轨。 ( 参考文献 ) ( 1 马绪荣，苏德模编.药品微生物检验手册[M].北京：科学出版 社.2000：24. ) ( 2 国家药典委员会编.中华人民共和国药典[S].二部.北京：化学 工业出版社，2000：附录 XIH无菌检查法91. ) ( 3 .国家药典委员会编.中华人民共和国药典[S].二部.北京：化学 工业出版社，2005：附录. ) ·启事· 欢迎订阅2005年《中国药学杂志》 《中国药学杂志》是由中国药学会主办，我国药学界创刊最早、发行量最大、反映我国药学各学科进展和动态的最具权威性和影响的综合性学术核心期刊之一。读者为高、中级药学工作者以及其他医药卫生人员。内容包括药学各学科，辟有专家笔谈、综述、论著(内容包括中药及天然药物、药理、药剂、临床药学、药品质量及检验、药物化学、生物技术)、药物与临床、新药介绍、药学史、药学人物、药事管理、学术讨论、科研简报等栏目。创刊50年来在医药卫生界享有很高声誉。连续获得国家科委、中宣部、新闻出版署主办的各种奖项。 从2005年起改为半月刊，大16开，80页，每本定价为10元。国内邮发代号：2-232；国外代号：M313。 编辑部地址：北京东四西大街42号；邮编：100710；电话：(010)65229531；传真：(010)65597969； E mail ：zgyxzz @.periodicals.net. cn；zgyxzz @yahoo. com. cn. ·Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.， Ltd. 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