先导化合物中药物检测方案(细胞分析)

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检测样品: 化药新药研发
检测项目: 化合物发现
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发布时间: 2017-07-11
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贝克曼库尔特国际贸易(上海)有限公司

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随着科学技术的日益发展,寻找和获得先导化合物的方法越来越多,而流式细胞术在先导化合物发现中扮演着越来越重要的角色。 确认人体免疫细胞细胞的最好方法之一是流式细胞术,它能根据细胞的显著特征(通常是外表面的蛋白)分析并分类细胞,同时显示很多关于一个细胞在免疫系统中的功能和位置的信息。

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流式在制药领域应用 VISUALIZE the possibilities. 目录 1.临床前研究阶段·...... 1.1先导化合物寻找…· .. 1.1.1离子通道抑制剂在制药中的应用· ..1 1.1.2酶活性检测…… 2 1.1.3疫苗方面的应用…mmmm 1.1.4耐药化合物的筛选…… 5 1.1.5荧光蛋白的应用…… …5 1.1.6生物标志物的寻找(Biomarker)). …6 1.2基因水平研究…… ... 1.3蛋白水平研究…… ... ..7 1.3.1细胞内的蛋白质相互作用…… …7 1.3.2噬菌体展示技术… 1.3.3微量样本多重蛋白定量技术…i.... 1.3.4 PHOSFLOW 在药物机制研究中的作用·........ 1.4细胞凋亡、周期和增殖在药物研究中应用…...... ..13 ·1.4.1细胞凋亡…. ....13 1.4.2细胞周期…… 14 2.临床研究阶段·..... ....15 2.1免疫力评估…… …..15 2.2微核实验…… .....16 2.3生殖毒性…… …17 3.分选应用·.... ….18 3.1 SP 细胞研究,寻求先导化合物….… .......18 3.2干细胞分选…… …·....19 流式在制药领域应用 1.临床前研究阶段 新药的临床前研究包括:药物的制备工艺、理化性质、纯度、检验方法、处方筛选、剂型、稳定性、质量标准、药理、毒理、动物药代动力学等研究,每一个步骤都涉及严格的质检和监控,而流式细胞仪作为一种高灵敏度、检测快速、操作简便的生命科学领域高尖端仪器,在制药领域的相关领域正发挥着越来越重要的作用。 1.1先导化合物寻找 先导化合物是指具有独特结构的有一定活性或潜在活性的化合物,是现代新药研究的出发点。它可能因为活性太小选择性不高、.药代动力学性质不好或毒性较大等缺点,不能直接作为新药开发,但可以在该化合物结构的基础上进行一系列的结构改造或修饰,得到符合治疗要求的新药。随着科学技术的日益发展,寻找和获得先导化合物的方法越来越多,而流式细胞术在先导化合物发现中扮演着越来越重要的较色。 1.1.1离子通道抑制剂在制药中的应用 离子通道广泛分布于各类兴奋性细胞,是电信号传导和扩大的主要介质,在神经细胞以及心肌细胞兴奋传导等方面发挥重要作用。比如钠离子通道结构和功能的异常,会改变细胞的兴奋性,因此导致多种疾病的发生,如神经性疼痛、癫痫,以及心律失常等,目前临床上多采用各类离子通道抑制剂治疗相关疾病。近些年,研究人员陆续从动物的毒液中分离纯化出具有调控离子通道功能的神经毒素,它们多为小分子多肽或化合物,现已有医药研发公司将这些天然的神经毒素进行定向设计改造成钠离子通道靶向药物用于临床疾病的治疗。 摘自: Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs Vijay Pralhad Kale etc.Biochimica et Biophysica Acta xxx (2015) xxx-xxx 在EPICS XL 上使用 Stem-Kit 试剂盒运用 ISHAGE 法定量检测造血干细胞 图释:制药过程中离子通道抑制剂的筛选流程 Study of the protective effect of calcium channel blockers against neuronal damage induced byglutamate in cultured hippocampal neurons Krzysztof Sendrowski etc. Pharmacological Reports.2013.65:730-736 图解:离子通道抑制剂在药筛中的实例。大鼠海马神经元细胞包含以下钙离子通道抑制剂 cinnarizine, flunarizine 和 nimodipine,取大鼠海马神经元细胞分为五个组, control 组不做任何处理, GLT 组用 glutamate 处理 15min 从而诱导细胞的死亡,剩余三组先分别用钙离子通道抑制剂 cinnarizine, flunarizine和 nimodipine 处理 60min 再用 glutamate 处里 15min,即GLT+F、GLT+C 和 GLT+N组,最后更换培养基培养到第二天,各组用Annexin V-FITC/PI染色检测细包凋亡坏死情況,结果显示面对 glutamate 诱导的大鼠海马神经元细胞死亡,flunarizine具有抗凋亡潜能, cinnarizine 则具有抗坏死潜能,而Nimodipine 具有抗坏死潜能,但能促进细胞的凋亡。 1.1.2酶活性检测 药物代谢酶活性测定一直是临床药理学科中较为活跃的研究领域,酶作为天然的生物催化剂,催化化学反应具有催化效率和立体选择性高、反应条件温和的特点。酶及作为酶源的微生物、动植物细胞是合成光学活性药物天然的手性催化剂。以水解酶为手性拆分催化剂,具有价格低廉、不需辅酶、拆分效率和立体选择性高等特点,已成功地用于光学活性药物及其合成子的制备,而流式以其灵敏度高、速度快以及简便性等强大功能因此在这方面的应用也逐渐提高。 摘自: ( I n vitro p r otein k ina s e a ctivity m eas u remen t b y f l ow cy t o metry ) ( Donald J. Bernsteel etc. Analytical Biochemistry 383 (2008)180-185 ) 图注:激酶检测原理,首先是生物素化的多肽通过高亲和性的生物素-抗生物素化作用结合到 LumAvidin 微球上,然后微球与激酶共孵育,磷酸化的多肽被抗磷酸化的一抗所识别,偶联上 PE 荧光素的二抗被加入,由于样本集聚于 LumAvidin 微球上,因此通过检测微球上的荧光信号可知酶活性。 600 图注:激酶浓度依赖的底物磷酸化。首先通过生物素-抗生物素化使 LumAvidin 微球上结合多肽底物,然后在80ul 的96孔板反应体系中加入40ul 激酶混合液,反应在加入40ul 微球多肽混合液后开始,实验条件是温度30°下孵育10min, 由图可以看出随着激酶 PKA量的增大,微球上检测到的荧光逐渐增强,表示底物多肽的磷酸化增强,直至一个饱和的激酶量。 图注:多参数条件下分析底物结合特异性。在该反应体系下激酶PKA为50ng/反应,底物为三种多肽混合物,浓度为50nM,最后检测微球上的荧光信号,虽然具有不同的底物,但是酶均为PKA激酶,因此结果只检测到了 PKA 组高荧光的表达,显示了酶与底物结合的特异性。 1.1.3疫苗方面的应用 疫苗在疾病预防中的地位日益重要,对疫苗质量的要求也日益提高。美国国立卫生研究院疫苗研究中心免疫学家Mario Roederer 表示,寻找对抗诸如艾滋病和疟疾等疾病的疫苗,一直因研究人员对人类免疫系统的了解不够充分而受到阻碍,研究人员能确认这些细胞类型,那么他们就可以设计出使这些细胞的生产最大化的疫苗,确认这些细胞的最好方法之一是流式细胞术,它能根据细胞的显著特征(通常是外表面的蛋白)分析并分类细胞,同时显示很多关于一个细胞在免疫系统中的功能和位置的信息。 摘自: Vaccine applications of flow cytometryStephen C. De Rosa. Methods 57 (2012) 383-391 Table 1Flow cytometric assays used in vaccine clinical trials. Assay Purpose Markers Measure Assays requiring ex vivo antigen-specific stimulation ICS Cytokines IFN-y, IL-2, TNF-a, and others of interest Immunogenicity, Cytotoxic potential CD107a, granzymes, perforin polyfunctionality B-cell help CD40L (CD154) Memory profile CD45RA, CCR7, CD27, CD28 Memory profile of vaccine- induced T cells CFSE proliferation Proliferation CFSE Immunogenicity Assays performed directly ex vivo Phenotyping Activation markers HLA-DR, CD38, Ki-67,BcL-2 Kinetics of immune response Innate cell markers Multiple markers for NK, DC, monocytes Innate cell changes at early time points Plasmablasts (transiently in circulation at CD3, CD19,CD20, CD27, CD38 Plasmablast frequency Cell sorting for further analyses Cell sorting for genomic/transcriptional 1-2 weeks) Cell types of interest Various markers Changes in bulk cell populations Antigen-specific T-cell isolation CD137, CD40L, MHC class I or class II Gene expression analysis tetramers Cell types of interest E.g., innate cell types Cell type-specific gene expression Antigen-specific B-cell isolation Plasmablast staining, antigen labeling Antibody cloning Requires ex vivo antigen-specific stimulation. 图注:流式在疫苗临床检测中的应用 图注:该方案显示的是正常人外周血 PBMC 细胞经过内毒素刺激6h后细胞因子的分泌情況,首先 CD3设门,然后研究门内CD4 和 CD8T细胞中的IFN-丫、IL-2、IL-17等胞内细胞因子的表达。 1.1.4耐药化合物的筛选 癌症是威胁人类健康的第一杀手,而化疗是癌症治疗的重要手段,在临床治疗中由于多药耐药(Multidrugresistance, MDR)的出现,造成化疗的失败。因此,探究药物产生耐药性的原因和寻找有效的克服耐药的药物显得尤为重要。 摘自: 256 1.1.5荧光蛋白的应用 GFP 具有荧光性能稳定、毒性小、对活细胞无害以及检测方便等优点因而常被用作荧光探针,当此信号分子与受体结合后常会发生细胞区域间间迁移,并在此过程中介导一系列生理功能,将 GFP 与生物学受体或药物分子偶联,信号分子的迁移会在细胞内留下轨迹,根据荧光蛋白的分布情況即可推断这些受体或药物分子的迁移状況,这些信息对药物分子的设计具有重要意义。 摘自: Leishmania (Viannia) panamensis: An in vitro assay using the expression of GFP for screening ofantileishmanial drug Ruben E. Varela M etc. Experimental Parasitology 122(2009)134-139 图注:该文献对 L. (V.) panamensis 转入 egfp,产生绿色荧光蛋白,借昔贝克曼公司的Epics XL 流式细胞仪完成抗利什曼虫药药物的筛选,该实验将L.(V.) panamensis 与 U937 共孵育感染,图(1)左上区显示的是未感染的 U937 细胞,右上区显示的是感染的 U937 细胞,右下区显示的是带 GFP 荧光的L.(V.)panamensis。图(2)和(3)分别显示的是用药物 meglumineantimoniate 以 O.3125 和20 Ig/ml 浓度药筛的结果,图(4)和(5)分别显示的是用药物 amphotericin B 以0.156 and 10 Ig/ml浓度药筛的结果,可以看出随着药物的添加和浓度的加大,感染的 U937 细胞逐渐减少。 1.1.6生物标志物的寻找 (Biomarker) 生物标志物指的是存在于人体内,能够对健康状況进行提示的多种不同的化合物,如 DNA、蛋白质、酶、脂质、糖类等。心脏病,多发性硬化症及其它多种疾病均有自己的生物标志物。比如有些肿瘤生物标志物可以对与肿瘤发展的侵袭性进行预测,因而成为有效的预后预测指标。 摘自: Mobilized CD34+ cells as a biomarker candidate for the efficacy of combined maximal tolerance doseand continuous infusional chemotherapy and G-CSF surge in gastric cancer Sang Joon Shin etc. Cancer Letters 270 (2008)269-276 Table 3 Changes of endothelial cells after chemotherapy Baseline (n=16) Before 2nd cycle chemotherapy (n=49) Before 3rd cycle chemotherapy (n=27) Mean % of Mean % of Mean % of (cells/ml) PBMCs (cells/ml) PBMCs (cells/ml) PBMCs CD34vWF+ 17.4±4.1 3.7 19.5±4.6 2.7 20.3±6.7 2.5 CD34 19.9十5.3 4.4 20.1±4.6 2.7 20.9±7.0 2.5 yWF+ 25.5±5.1 5.5 30.0±6.3 4.8 29.2±6.7 7.2 P1H12 11.6十5.1 3.1 12.9±3.2 12.9 11.3±2.6 2.0 CD31+ 125.3土28.2 28.2 214.3±40.0 26.5 158.5±53.6 18.2 图注:胃癌患者外周血 PBMC用带有荧光的 CD34, vWF 等相关标志物染色,并借助贝克曼公司的 EPICS XL 流式细胞仪检测,评估胃癌患者基于 taxotere 化学疗法后其骨髓来源前体细胞和成熟的内皮细胞是否可作为疗效评估,结果显示 CD34+/vWF+和 CD34+均可作为疗效预测 biomarker, 而CD34 还可作为预后 biomarker。 源于荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术,首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记,然后用原位杂交法与靶染色体或 DNA 上特定的序列结合,再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染体上的位置,最后结合流式细胞仪来检测。在临床中可用于细胞特定亚群端粒长度的检测以及白血病,特别是不具特异性分子生物学标记的白血病患者相关研究的有效手段。 表1 荧光原位杂交实验条件优化 M RSA 阳性率(%) 试验号 A B C M RSA (菌液浓度) (探针浓度) (温度) 阳性率 1 1 1 1 23 2 1 2 2 45 3 1 3 3 48 4 1 4 4 50 5 2 1 3 35 6 2 2 4 47 7 2 3 1 41 8 2 4 2 50 9 3 1 4 34 10 3 2 3 44 11 3 3 2 49 12 3 4 1 29 13 4 1 2 38 14 4 2 1 49 15 4 3 51 16 4 4 3 61 注:A因素1、2、3、4分别代表每微升杂交缓冲液含细菌数(CFU/Hl)5×105、10×105、20×105、40×105;B因素1、2、3、4分别代表每微升杂交缓冲液含1、2、4、8ng探针;C 因素1、2、3、4分别代表42、46、50、54℃的杂交温度。 图释:该文献借助贝克曼公司的 EPICS XL 流式细胞仪,在不同的菌液浓度,探针浓度和温度下,作者筛选出最佳的杂交条件为:菌液浓度40×105 CFU/u1、探针浓度4ng/u1、杂交温度50℃。同时作者将荧光原位杂交法流式细胞术法与荧光实时 PCR 法检测 M RSA 结果比较,以 PCR 法为“金标准”,FISH-FCM法的检测敏感性为97.3%,特异性为100.0%。与 PCR 法相比差异无统计学意义。 先导化合物是指具有独特结构的有一定活性或潜在活性的化合物,是现代新药研究的出发点。它可能因为活性太小、选择性不高、药代动力学性质不好或毒性较大等缺点,5,不能直接作为新药开发,但可以在该化合物结构的基础上进行一系列的结构改造或修饰,得到符合治疗要求的新药。随着科学技术的日益发展,寻找和获得先导化合物的方法越来越多,而流式细胞术在先导化合物发现中扮演着越来越重要的较色。 图释::CFP-YFP FRET 作为蛋白相互作用指示的基础,当 CFP 融合蛋白和YFP 融合蛋白的发色团相距足够近,则FRET发生。413nm 的激光能量激发 CFP, 能量再转移到YFP,最终发出530nm 的黄色荧光。假如 CFP 融合蛋白和 YFP 融合蛋白不相互接触,则 CFP 和 YFP融合蛋白的发色团就会因为相距太远而无法引起FRET, 因此只有 CFP荧光发出(475nm) 图释:流式分析酵母细胞 CFP-YFP FRET 的应用,其中A和C为阴性对照,表达自由的 CFP和融合的YFP蛋白,B和D 为实验组表达融合的 CFP 和YFP蛋白, CFP、YFP以及 FRET 荧光信号由流式细胞仪收集,由图可以看出A 和C组未出现FRET, 因为它们表达的是自由的 CFP蛋白而不是融合的CFP 蛋白,而B和D组由于表达的是融合的 CFP 和YFP蛋白,因此此约60%的酵母细胞表现出了 FRET 2) 摘自 Min-Kyung Sung 等人的研究成果 B 图释:该图显示的是 HY0837, HY0838 和 HY0839 三种细胞,其N端启动子分别为 CET1, HXK2 和RPL7B, 同时其C端启动子均为 RPL7B, 在荧光显微镜下可发现 HY0837, HY0838 和 HY0839 三种细胞的细胞核均有荧光,但是亮度却不同,并证明其与C端的 Cet-1表达水平有关,为了定量分析 FITC 荧光水平,作者运用流式细胞仪对三种细胞发出的荧光进行检测,发现HY0837 细胞的 FITC荧光强度是145道,而HY0838 和 HY0839的荧光强度分别是203道和220道,最终作者得出结论,调节 Cet-1的表达水平,可诱导 Cet-1 和 Cet-1相互作用的数量改变,而这可借助流式细胞仪运用 BiFC 得以检测。 1.3.2噬菌体展示技术 噬菌体展示技术作为药物靶点筛选工具中的一种有效工具,它可以将外源蛋白或多肽呈现在噬菌体表面,利用外源蛋白或多肽与待筛选药物的特异性亲和作用,通过吸附-洗脱-扩增的筛选富集过程,将表达与药物特异性结合的外源蛋白或多肽的噬菌体大量富集,然后通过测序分析即可得到与药物特异性结合的外源蛋白或多肽。 摘自Caixia Ma 等的研究成果 DAPI Dil FITC Merge A B D E 图释:作者从14种多肽序列中通过竞争抑制实验挑选出与食管鳞状癌细胞具有最佳亲和性的 ESCP9肽段,将其转入食管鳞状癌细胞 Eca-109,挑选出阳性细胞,在荧光显微镜下观察可发现 FITC标记的 ESCP9 肽段能结合到Eca-109 细胞(图A)和TE-1细胞(图B,该细胞为食管鳞状癌细胞),但不能不合到 HEK-293细胞(图C,该细胞为人胚胎肾细胞,对照),同时 FITC标记的对照阴性多肽与该三类细胞(图DEF)不显示出结合亲和性。染色细胞核为蓝色(DAPI),细胞质膜为为红色(Dil),多肽为绿色 (FITC) F 图释:进一步用流式分析 ESCP9 肽段与 ESCC细胞的结合, FITC 标记的 ESCP9多肽(绿色线)和 FITC 标记的对照多肽(红色线)分别与 Eca-109 (A),TE-1 (B), and control HEK293 cells (C)孵育, PBS 作为空白对照(黑色线)。FITC 标记的ESCP9 与 ESCC细胞结合后荧光强度值为22.47,i而对照多肽和 PBS组的荧光强度分别为11.65和10.65,同样的FITC标记的ESCP9 与TE-1细胞结合后荧光强度值为17.94,对照多肽和 PBS组的荧光强度分别为 10.79 和11.85,从而说明了 FITC标记的 ESCP9 肽段与 ESCC 细胞具有结合亲和性,提示ESCP9 肽段可作为制药中的一个靶点。 1.3.3微量样本多重蛋白定量技术 该技术利用一系列带有荧光标记的微球连结特定的捕获抗体以捕捉溶液系统中的待测物,然后再通过相对应的各种不同检测物特异微球上的不同荧光强度同时定量测定分析样本中多种可溶性成分,可检测包括细胞因子、趋化因子、生长因子和磷酸化细胞信号蛋白等在内的多种蛋白,该技术已经较为成熟,在任何一台流式细胞仪上均能完成 摘自: Lactic acid bacteria as adjuvants for sublingual allergy vaccinesLaurence Van Overtvelt etc. Vaccine 28(2010)2986-2992 Standard Curve (A)5000· Medium alone 图释::1该文章运用贝克曼库尔特公司 FC500 流式细胞仪检测medium, L. helveticus 和 L. casei 对 DC 细胞表型和细胞因子产生带来的影响,A图显示的是三种不同刺激物对DC细胞表型 marker的荧光强度影响,B图显示的是运用CBA 微球技术,检测细胞因子的产生。 1.3.4 PHOSFLOW 在药物机制研究中的作用 蛋白质是由氨基酸组成的,丝氨酸、酪氨酸以及苏氨酸等的残基磷酸化对蛋白活性有重要影响,进而影响生命活动中的相关事件。比如相关激酶通过调控细胞信号通路的胞内蛋蛋和膜蛋白上受体蛋白的磷酸化,影响细胞的凋亡、细胞周期、生长以及趋化等。深入了解这新信号通路对进一步研究相关疾病具有重要的指导意义。 摘自: Analysis of protein phosphorylation and cellular signaling events by flow cytometry: techniques andclinical applications Comparison of phospho-specific flow cytometry and traditional techniques Western blot Flow cytometry Population analysis Single cell analysis Obtain average value Collects data for each of multiple cells individual cell Homogeneous sample Heterogeneous cell types Limited to cultured Complex primary samples, or purified cells that is, immune cells One parameter Multiparameter Obtain data sets Correlate multiple markers individually simultaneously Large number of cells Small number rare subsets Requires in vitro derived Direct analysis of rare cell cultures of rare cells types (i.e.,DC) Time consuming for large Rapid and scalable sample sets Performed in 96-well Not amenable to large plates in parallel screening efforts Protein size Ab must be validated and Ab specificity Ab must have high affinity Ab selectivity for target and selectivity is clearly visible 1图注:相对传统的 western blotting, 流式在蛋白磷酸化研究中的优势。 Sample 图解:单个细胞分析的优势。A中,假设三个样本包含我们感兴趣的蛋白,该蛋白在细胞中的拷贝数分别为1,10和50.则该蛋白在三份样本中每个细胞上的平均表达分别为1,5和5。图B则表示这三份样本均用 western blotting分析时,样本2和样本3表达显著高于样本1,但是样本2和3灰度却一致。图C则显示该兴趣蛋白用荧光标记并用流式进行分析,我们在样本2中会发现有两个不同荧光强度的峰,,它们所代表的细胞数相等,在样本了中则发现只有十分之一的细胞荧光强度有升高,从而显示了流式分析的强大。 图解:流式磷酸化染色的步骤。 步骤1: 异质的细胞群经受A和B两种刺激(药物,细胞因子,抑制剂等),从而引起信号级联以及靶蛋白的磷酸化,第三个样本则同时用A和B刺激, 步骤2:细胞被固定,破膜,并用荧光标记的磷酸化抗体对两种磷酸化的蛋白进行标记。 步骤3:依靠流式细胞仪对细胞进行分析,由于荧光标记的抗体与磷酸化的蛋白结合,因此磷酸化程度越高那么荧光的强度也越高,A刺激剂引起红色荧光增强因为红色蛋白被磷酸化。同时A和B刺激则引起两种蛋白的磷酸化,产生红色和绿色荧光。 在临床上使用信号通路相关的药物时,该技术可用于检测疾病进程中该类药物的疗效,监测异常的细胞信号。 A 图解:流式多重参数分析磷酸化 小鼠的脾脏细胞用 IFN-v刺激(填充的柱状图)和不用 IFN-v刺激(空白的柱状图),然后用抗体B220, TCR-B,and CD11b 染色区分B细胞(蓝色),T细胞(红色)和单核树突细胞(绿色),最后用磷酸化特异性抗体分析其Stat1 和 Stat5 磷酸化。结果显示T和B细胞面对IFN-v刺激显示出了明显的 Stat1磷酸化,而单核树突细胞群则表现出了不同程度的 Stat1磷酸化,同时少量的诱导了 Stat5 的磷酸化。 1.4细胞凋亡、周期和增殖在药物研究中应用 凋亡和细胞周期的紊乱与疾病的关系密切,全面、系统地研究凋亡机制以及细胞周期调控各个因素的作用对我们预防和治疗癌症等相关疾病具有重要意义。目前临床应用于抗肿瘤或抗凋亡的药物不仅疗效不容乐观,而且大多数药物(尤其化学合成剂)都对正常细胞有毒副作用。因此,寻找毒性低、疗效好的相关药物仍然任重而道远,随着对细胞凋亡和周期调控机理研究的深入,会有越来越多的相关药物用于疾病的治疗,造福人类。 1.4.1细胞凋亡 摘自: The apoptotic effect of nanosilver is mediated by a ROS-and JNK-dependent mechanism involvingthe mitochondrial pathway in NIH3T3 cells Yi-Hong Hsin etc. Toxicology Letters 179 (2008)130-139 (A) Annexin V-FITC 图释:该实验借助贝克曼公司的 FC500流式细胞仪研究 NIH3T3 和HCT116细胞在nanosilver(分别来自于Sun-Lan 和 Ching-Tai) 处理72h 下细胞的早期凋亡、晚期凋亡和坏死情況。 1.4.2细胞周期 摘自: Effects of anti-inflammatory drugs on proliferation, cytotoxicity and osteogenesis in bone marrowmesenchymal stem cells (EPICS Elite; Coulter) Je-Ken Chang etc. biochemicalpharmacology74(2007)1371-1382 图释:该实验借助贝克曼公司的 EPICS XL 流式细胞仪,取小鼠骨髓间充质干细胞 (D1-cell)分为七组,分别用非类固醇类抗炎药(indomethacin, ketorolac, diclofenac and piroxicam)、甾体类抗炎药(dexamethasone)、COX-2选择性作用的非类固醇类抗炎药 (celecoxib 和 DFU)处理,然后用PI染色,流式分析各组中 D1-cell 周期,结果显示这些药物后,相对空白组,各个药浓度下 D1-cell 周期中 GO/G1 百分比均大幅提高,S期百分比降低,说明这些药物作用于 D1-cell 并将细胞周期阻滞在了GO/G1 期。 2.临床研究阶段 新药的临床研究包括临床试验和生物等效性试验。临床试验分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。|期临床试验:为初步的临床药理学及人体安全性评价试验。观察人体对于新药的耐受程度和药物代谢功力学,为制定给药方案提供依据。Ⅱ期临床试验:为随机盲法对照临床试验。对新药有效性及安全性作出初步评价,推荐临床给药剂量。Ⅲ期临床试验::为扩大的多中心临床试验。遵循随机对照原则,进一步评价药物的有效性及安全性。Ⅳ期临床试验:为新药上市后监测。在广泛使用条件下考察疗效和不良反应。药物安全性评价是指为评价药物的安全性,在实验室条件下,用实验系统进行的各种毒性实验,药物的安全性评价对判断一种药物能否进入临床研究,预测临床研究的风险程度和为临床研究提供重要的安全性依据起着重要的作用。下图为药物安全性研究 (Safetypharmacology study)的流程。 2.1免疫力评估 摘自: Phase I/ll study of adjuvant immunotherapy with sentinel lymph node T lymphocytes in patients withcolorectal cancer YunHuan Zhen etc. Cancer Immunol Immunother.DOI10.1007/sO0262-015-1715-3 图释:该图显示的是使用贝克曼公司的FC500流式细胞仪对结肠癌病人外周血和淋巴结中的 CD19+、CD3+等免疫细胞的检测和评估 2.2微核实验 染色原理:采用EMA 和 SYTOX Green 双色标记技术, EMA荧光信号收集在 FL3 通道, SYTOX Green 荧光信号由FL1通道收集, EMA 可穿过凋亡或坏死细胞的细胞膜,在光活化条件下与 DNA 以共价键结合,但无法穿过正常细胞膜与 DNA结合;;EMA染色结束时采用缓冲液洗细胞,并用含RNA酶及细胞膜裂解液的 SYTOXGreen 染液染色所有细胞的细胞核。通过EMA 和SYTOX Green 双染料染色以区分正常细胞和凋亡、坏死细胞,达到排除凋亡或坏死细胞对试验结果的影响的目的,并加入计数珠用于评价化合物的细胞毒性 摘自: Steven M. Bryce etc 等的研究成果 FL1-H 图注:流式二维参数图分析 TK6细胞核和亚细胞颗粒。该设门策略用于将细胞核和微核与凋亡的染色质以及其他杂信号区分。首先A图将细胞和微球界定与一个区域,B图排除黏连体, C图选取G1期细胞核至少大于1/100范围内的荧光信号,D图用FSC vs SYTOX圈出相关颗粒,E图用 SSC vs SYTOX圈出相关颗粒,F图设置EMA 阳性门。 图释:TK6细胞分别用 solvent (对照)和 Etoposide (药物)处理,如图A和D结果显示, Etoposide处理后EMA Positive 区域比例增加,说明 Etoposide 促进了TK6细胞的凋亡和坏死。而B和E图由SYTOX 的荧光可以看出 Etoposide在细胞周期方面降低了S期比例,增加了G2M期比例。最后,F图相对C图MN多边形门比例增加可以看出 Etoposide 促进了微核的增加,显示了 Etoposide 的细胞毒性。 2.3生殖毒性 摘自: Evaluation of in vivo reproductive toxicity of potassium chromate in male miceHelena Oliveira etc. Experimental and Toxicologic Pathology 62 (2010) 391-404 Table 3. Effects of K2CrO4 on sperm cell’s density, motility, viability and mitochondrial function, 5 and 35 days after start ofexposure. 5d 35d Control 5mg 10 mg Control 5mg 10 mg Density (x10°) 6.7±1.19 5.6±0.81 5.18+0.98 9.8+0.76 8.9±1.52 11.1±2.50 Motility (%) Progressive 40.8±1.64 28.2±2.19** 24.0±2.17** 37.0+2.42 38.2±2.80 34.7±1.12 Non-progressive 6.7±0.78 12.5+1.93 8.5±1.78 15.7±1.64 10.0±1.83* 10.6±0.8* Immotile 52.5±1.93 59.3±3.04 67.5±2.43** 47.2±2.10 51.8±2.94 54.7±1.5* Viability (%) PI+SYBR+/PISYBR* 37.3+5.40 34.1+6.23 34.3±4.64 37.2+2.14 34.3+1.6 32.6±2.32 Mitochondrial function (%) PI+Rh+/PIRh+ 15.9±1.09 15.3±1.38 14.7±0.5 18.8+3.11 16.20±1.91 14.2±0.9 Mean values±SE *p<0.05; **p<0.001. 图注:该该献运用贝克曼公司的 FC500 流式细胞仪研究 K2CrO4 对小鼠精细胞的功能影响。其中 PI+/SYBR+ 为死细胞, Pl+/SYBR+为活细胞,而线粒体功能研究中, Rh+为有功能的线粒体。 3.分选应用 流式细胞分选技术具有检测速度快、统计学精度高、可在分析的同时把具有指定特征的细胞分选出来等特点,因而应用范围广泛,包括肿瘤干细胞分选、外周血细胞分选、染色体分离、稳定细胞转染株筛选等方法,比如肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新、无限增殖及多向分化潜能的细胞,这部分细胞虽然只占少部分,但在肿瘤的发生、演进、复发、耐药及逃逸免疫系统的识别和清除过程中可能发挥了至关重要的作用。因此,建立有效的肿瘤干细胞分离方法,将有助于人们深入了解肿瘤的发病机理,从而建立新的有效的治疗方法。 3.1SP 细胞研究,寻求先导化合物 摘自: Secalonic acid D reduced the percentage of side populations by down-regulating the expression ofABCG2 Ya-peng Hu etc. Biochemical Pharmacology 85(2013)1619-1625 ( 图注: S ecalonic acid D (SAD)的化学结构 ) A 图注:针对肺癌患者 SP 细胞群先导化合物的探索。 ABCG2 被认为是癌症干细胞的识别标志物,作者运用流式对侧群干细胞(SP)细胞进行分选,然后研究SP 和NSP细胞群中 ABCG2的表达情況,流式显示 SP 细胞中 ABCG2表达增强,意味着 ABCG2在拥有 SP 表型。 本实验再 Beckman Coulter 公司的Moflo XDP上完成。 A 图注:用Hoechst33342 对A549、Glc-82和H460细胞中的SP细胞染色,分别或联合用 SAD 和 Verapami(阳性对照)处理,结果发现 SAD 降低了SP的比例,因此 SAD 有望成为肺癌病人中对抗癌症干细胞的一个先导化合物。 3.2干细胞分选 摘自: Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human LiverMeritxell Huch etc. Cell 160, 299-312, January 15, 2015 (legend on next page) 图注对肝脏标本消化成单个细胞后,利用EpCAM(CD326)和PI染色,EpCAM-PI-为活的肝细胞,EpCAM+PI-为导管上皮细胞,利用 moflo 分选仪进行单个细胞分选后培养,只有EpCAM+PI-能继续生长。 图注:此图为分选后的 EpCAM+PI-单个细胞,随着时间的推移,形成克隆生长。该细胞稳定,在回输体内后便能形成有功能的肝细胞(肝细胞无法在体外培养环境下扩增和具有功能)。运用流式分选然后培养出肝细胞,这使我们能在诸多肝脏相关疾病模型(比如急性肝损伤)中更直接的研究其毒理作用,以及进行药物实验。 本实验再 Beckman Coulter 公司的 Moflo XDP 上完成。 只识 归 贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司 全国产品咨询热线:4008218899 全国售后服务热线:4008855355/800820 5355 官方微信 上海 北京 广州 杭州 福州 成都 昆明 口 021-38651000 010-65213000 020-85187188 0571-8767 8208 0591-8850 5800 028-86210135 0871-63617528 南京 武汉 西安 济南 郑州 沈阳 哈尔滨 025-6667 6033 027-88232300 029-8833 7440 0531-80965011 0371-55637430 024-31958690 0451-55550637 口 手机官网 BECKMANCOULTERLife Sciences 美国国立卫生研究院疫苗研究中心免疫学家Mario Roederer 表示,寻找对抗诸如艾滋病和疟疾等疾病的疫苗,一直因研究人员对人类免疫系统的了解不够充分而受到阻碍,研究人员能确认这些细胞类型,那么他们就可以设计出使这些细胞的生产最大化的疫苗,确认这些细胞的最好方法之一是流式细胞术,它能根据细胞的显著特征(通常是外表面的蛋白)分析并分类细胞,同时显示很多关于一个细胞在免疫系统中的功能和位置的信息。源于荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH) 技术,首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记,然后用原位杂交法与靶染色体或DNA 上特定的序列结合,再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染体上的位置,最后结合流式细胞仪来检测。在临床中可用于细胞特定亚群端粒长度的检测以及白血病,特别是不具特异性分子生物学标记的白血病患者相关研究的有效手段。
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