山茱萸中丁香酚的含量检测方案

责任编辑 姜丽责任校对傅真治安徽农业科学， Joumal of AnhuiAgri SSci 2010，38(11)：5612-5613 561338卷11期黄先敏等i高效毛细管电泳法测定山茱萸中丁香酚的含量 高效毛细管电泳法测定山茱萸中丁香酚的含量 黄先敏，伍文聪，吴银梅，祁岑* (昭通师范高等专科学校，云南昭通657000) 摘要[目的]建立山茱萸(Comus officinalis Sieb et Zucc. )药材中丁香酚含量的测定方法。[方法]毛细管柱，未涂层毛细管(50 cm x50|m，有效长度40 cm)；1×TBE缓冲液；分离电压，20 kV；检测波长，280 mm；温度，15℃；进样条件，压力差进样，10s进样高度，8 cm。每天分析之前，分别用0.1 mol/L氢氧化钠溶液、重蒸水、缓冲液冲洗毛细管先5 m in；进样前分别用 0.1 mol/L氢氧化钠、重蒸水、运行缓冲液冲洗 3min。[结果]丁香酚在0.08~1.00 mg/ml范围内与峰面积积分值线性关系良好，回归方程y=19 760 03x-19 02(R’=0. 990 3)，平均回收率为 97.5%，RSD值为 1.46%(n=6)。[结论]该法简便、准确、重复性好，有助于山茱萸质量控制方法的研究。 关键词山茱萸；丁香酚；毛细管电泳 中图分类号R284.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2010)11-05612-02 Determ ination of Eugen ic Acid Content in Cornus officinalis Sieb et Zucc by HPCE HUANG Xanm in et al (Zhaotong Teacher’s College， Zhaotong， Yunnan 657000) Abstract[Objective] The paper aimed to develop a HPCE method for detemm ination of Eugenic acid in Comus officinalis Sieb et Zucc. [Meth-od] Capillary column， uncoated capillary (50 cm x50p m， effective length 40 cm)；1 ×TBE buffer， Separation voltage，20 kV； detection wave-length， 280 nm； temperature，15 ℃； sampling conditions， the pressure differential injection， 10 s， sampling height，8 cm. Before analyzing， cap il-lary column was rinsed with 5 m in with 0.1 mol/L sodium hydroxide solution， re-distilled water and buffer solution Before sampling， 0. 1 mol/Lsodium hydroxide， distilled water and running buffer rinsed with 3 min[Result] Eugenol had a good linear relationship with the peak area of in-tegral linearity at the range of 0. 08- 1.00 mg/ml， the regression equation y=19 760 03x- 19 02 (R’=0.990 3)， the average recovery was97.5%，RSD为 1 46%(n=6). [Conclusion] The method is simple， accuracy and good repeatability， which is contributed to quality control of Comus officinalis Sieb et Zucc. Key wordsComus officinalis Sieb. et Zucc； Eugenic acid； HPCE 山茱萸 (Comus officinalis Siebet Zucc)，别名山萸肉、枣皮、萸肉，山山茱萸科落叶小乔木。随着现代医药科技的飞速发展，延缓衰老、健康长寿已成为广大人民群众日益期盼的需求。中药材山茱萸因含有丰富的营养和珍贵的保健成分及微量元素，已成为科学研究的热点。山茱萸的干燥成熟果肉，是古代使用频率最高的25种植物药之一。山茱萸，首载《神农本草经》，主心下邪气、寒热、温中和逐寒湿痹。山茱萸中含有丁香酚，近年来的研究表明，其有抑菌、麻醉、解热、抗氧化、抗肿瘤、促进透皮吸收和祛蚊等多种药理活性。目前，测定丁香酚的方法主要有高效液相色谱法[4-8]，但分析耗费试剂成本高，过程较繁琐；应用毛细管电泳测定丁香酚含量的报道不多12.91，且也存在分析耗费试剂成本较高，过程较繁琐的不足。为此，笔者建立了高效毛细管电泳法测定山茱萸中丁香酚含量，以期为山茱萸的质量控制提供科学依据。 1材料与方法 i.1材料 1.1.1研究对象。山茱萸，购自昭通市中药材公司，经昭通师范高等专科学校陈屏昭教授鉴定为山茱萸(Comus offici-nalis Sieb et Zucc )。 1.1.2主要试剂。丁香酚对照品，昆明科翔生物科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、硼酸、磷酸氢二钠NaHPO)均为分析纯。 1.1.3主要仪器。CL1020型高效毛细管电泳仪，由北京彩陆科学仪器有限公司生产，检测波长为190~700 mm；未涂层弹性石英毛细管柱(50[mid，总长 50 cm，有效长度40 ( 基金项目云南省教育厅科研基金项目 (09C0201)。 ) ( 作者简介黄先敏(1973 - )，女，四川内江人，硕士，讲师，从事中草药成分分析及利用方面的研究。 * 通讯作者， Ema i l： qicen- 1 969@yahoo com. c n。 ) ( 收稿日期 2010-01-11 ) cm)，由河北永年光导纤维厂生产；pHS-3B酸度计，由上海雷磁仪器厂生产； H6605型超声清洗机，由无锡电子设备厂生产。 1.2方法 1.21对照品溶液的制备。准确吸取丁香酚纯品 50p1(相对密度1.058)，溶解于50ml重蒸水中，摇匀。经0.45 m微孔滤膜过滤，即得浓度为 1 mg/ml的对照品溶液。 1.22供试品溶液的制备。将山茱萸粉碎为粉末，准确称取3g，加入重蒸水 50ml，静置20 h，超声提取 0.5 h，青置1.0h，取上清液，经0.45um微孔滤膜过滤，即得。 1.23缓冲液的选择。确定色谱条件时，固定参数为：毛细管柱，未涂层毛细管(50 cm x50pm，有效长度40 cm)；分离电压，20 kV；检测波长，280 mm；温度，15℃；进样条件，压力差进样，10s；进样高度，8 cm。另选取1×TBE缓冲液 (Tris- base 1.08 g，硼酸 0. 55 g，Na EDTA 0. 074 4 g，定容至100ml)和 60mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(pH值802)进行电泳，以选取最优缓冲液。每天分析之前，分别用0.1 mol/L氢氧化钠溶液夜洗毛细管柱、重蒸水冲洗、缓冲液冲洗5 min；进样前分分用0.1 mol/L氢氧化钠、重蒸水、缓冲液各冲洗3min. 1.24 方法学考察。 1.241检出限的考察。将丁香酚对照品稀释成不同浓度，按"1.23"下确定的色谱条件进样，以确定检出限。 1.242线性关系考察。准确吸取“1.21"卜对照品溶液5ml，再吸取重蒸水 5ml稀释，摇匀。取该溶液1ml，共5份，依次加入重蒸水0.3、6、9、12 ml，摇匀，与原对照品溶液分别按"1.23"下确定的色谱条件进样，测定峰面积积分值，以峰面积积分值(y)为纵坐标，相应对照品溶液浓度(x)为横坐标进行线性回归，得回归方程。 1.243精密度试验。取“1.21"下丁香酚对照品溶液，在 优化的色谱条件下连续重复进样5次，测定丁香酚峰面积积分值，计算相对标准偏差(RSD)。 1.244重现性试验。取同一供试品6份，份别按"1.22”下方法制备溶液，按"1.23"下色谱条件进样，测定丁香酚峰面积积分值，计算 RSD。 1245稳定性试验。按"1.22"下方法制备1份样品，按"1.23"下色谱条件进样5次，每次间隔约2 h，测定丁香酚峰面积积分值，计算 RSD. 1.24.6加样回收率试验。将对照品溶液按不同比例稀释，然后与样品溶液按11比例混合，测得加样回收率及RSD. 1.25样品含量的测定。取3批山茱萸药材，按"1.22"下方法制备，并按"1.23"下色谱条件进行测定，计算含量。 2结果与分析 21缓冲液的选择结果由图1可知，选取1×TBE缓冲液进行电泳时，样品分离效果较好，且峰形良好，在供试品与对照品图谱中相同保留时间处有色谱峰。 16r 保留时间Retention time l/ min 注：A为丁香酚纯品(1mg/ml)；B为丁香酚纯品10%+供试样占 90%；C为供试样品；1为丁香酚。 Note： A Eugenic acid1 (1 mg/ml)；B 10% Eugenic acid+90% sam-ple； C Sample； 1. Eugenic acid 图1在1×TBE缓冲液条件下的毛细管电泳图 Fig 1 Capillary electrophoresis under 1xTBE buffer cond ition s 由图2可知，选取 60 mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(pH值8.02)进行电泳时，在供试品与对照品图谱中相同保留时间处有色谱峰，样品分离效果较好。与使用 TBE缓冲液相比，虽然出峰时间提前，但峰形较差。故选择在1×TBE缓冲液条件下进行试验。 22方法学考察结果 221检出限的考察结果。由图3可知，当丁香酚对照品浓度为0.01u g/ml时，依然有明显的可见峰，确定方法的检出限为0. 01p g/ml. 222线性关系考察结果。所得回归方程为 y=19 760 03x+19 02(R’=0. 990 3)，丁香酚检测浓度在0.08~1.00mg/m范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。 223 精密度试验结果。计算得丁香酚含量的 RSD =1. 16%，表明仪器精密度良好。 保留时间 Retention time ll min 注：A为丁香酚纯品(1mg/ml)；B为丁香酚纯品10%+供试样品 90%；C为供试样品；1为丁香酚。 Note： A Eugenic acid (1 mg/ml)；B 10%Eugenic acid +90%sample； C Sample 1. Eugenic acid 图2在60mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(pH值802)环境下的毛细管电泳图 Fig 2Capillary electrophoresis under 60 mmol/L disodium hydrogen phospha te buffer solution (pH value 8 02) conditions 注：1为丁香酚。 Note： 1. Eugenic acid 图33丁香酚浓度为0.01pg/ml时的毛细管电泳图 Fig 3 Capillary electrophoresis with 0. 01 p g/ml eugen ic acidconcen tra tion 22.4重现性试验结果。测得样品中丁香酚含量分别为1.87、1.86、1.89、1.75、1.85、1.93 mg/g，RSD=1. 20%，表明样品处理过程和测定方法均有良好的重现性。 225稳定性试验结果。测得10 h内样品稳定性良好，丁香酚含量的 RSD =0.96%，表明溶液在10h内稳定。 226加样回收率试验结果。由表1可知，测得样品的回收率在96.2%~988%，平均为 97. 5%，RSD在 1. 10%~1. 80%，平均为1.46%. 表1加样回收率试验结果(n=6) Table 1 Results of recovery test 试验号样品含量 I mg 加入量 测得量 l mg E 回收率Ⅱ% RSD Test Samp les mg Detem ined Recovery % No content Dosage quantity rate 112 0 62 5 173. 12 97.6 2 1120 125 235.50 98.8 3 1120 250 352 50 96.2 1.5 (下转第5618页) 优先发展川西高原区、甘南地区，以四川阿坝、松潘、若尔盖、红原、马尔康、道、白玉、炉霍，甘肃卓尼、夏河、部、玛曲、舟曲等适生区面积大的地区为主体。中长期发展建议可发展藏东高山-三江中段，以西藏昌都地区妥坝县、察雅、贡觉等县为主，向南延伸至芒康、向北可拓展至青海玉树、囊谦地区。藏南山原谷地的山南地区和林芝地区的部分地区也可利用生态走廊适度发展。根据自然生态环境，在海拔2600~4 100m的山坡、河谷、河滩、草丛及高山草甸处建立藏茵陈野生抚育区或生产基地，不仅对藏茵陈资源保护和可持续发展具有重要意义，也可充分发挥对地区生物、生态多样性及饮用水源的涵养和保护作用。 ( 参考文献 ) ( [1]唐丽，金振南，门美.藏药藏茵陈的研究进展及开发利用[J].中央民族 大学学报：自然科学版，2007，16(2)：176- 1 78 ) ( [2] JOSHIP， D HAWAN V. 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