小活络丸中乌头碱检测方案(毛细管电泳仪)

2009年10月第31卷 第10期October2009Vol 31 No 10中成药Chinese Traditional PatentMedicine 表4 淫羊藿苷含量测定结果 批号 淫羊藿藿含量/(mg/袋) 平均值 RSD/% 2 3 (mg/袋) 080801 4.172 4.068 4.015 4.085 1.96 080802 4.183 4.167 4084 4.145 1.28 080803 4.315 4216 4.187 4.239 1.58 3 讨论 3.1 淫羊藿薄层色谱鉴别中，曾采用多种吸附剂铺制薄层板，并用不同的溶剂系统为展开剂进行试验，阴性均有干扰，后将样品上聚酰胺柱洗脱后，消除了阴性干扰，获得了较为理想的薄层鉴别方法。 3.2 黄芩为扶阳解毒颗粒的君药、淫羊藿为臣药，因而选择黄芩的有效成分黄芩苷及淫羊藿的有效成分淫羊藿苷为该药的定量指标，经方法学考察，该方法准确、简便，能控制黄芩苷、淫羊藿苷的含量。 3.3 中国药典规定的淫羊藿含量为叶中淫羊藿苷的含量，叶中黄酮类化合物含量最高，根次之，茎最低。而药典规定的淫羊藿入药部位为干燥的地上部分，因此生产中是以地上部分入药的，其实际药用部位中淫羊藿苷的含量较低，所以成品的含量测定结果也偏低。 ( 参考文献： ) ( [1] 中 国药典[S].一部.2005：211；2005：229. ) ( [2 ] 康 廷国.中成药薄层色谱鉴别[M].北京：人民卫生出版社， 1995：293. ) ( [3] 刘 明，李更生，王慧森.清开灵分散片质量标准研究[J].中 华中医药刊，2008，26(2)：417-420. ) ( [4] 关 郑 军，李晓亮，熊 非，等. HPLC法测定强阳胶囊中淫洋藿 苷的含量[J].现代中药研究与实践，2006，20(5)：38-40. ) 小活络丸中痕量毒性成分乌头碱的快速限量检测 张 剑. 李 蒋 晔2* (1.河北医科大学生物科技总公司，河北石家庄050017；2.河北医科大学药学院，河北石家庄050017) 关键词：毛细管电泳场放大富集技术；小活络丸；乌头碱；快速限量检测 摘要：目的：建立毛细管电泳场放大富集技术快速检测小活络丸中痕量毒性成分乌头碱的方法。方法：采用非涂渍石英毛细管(50 um i d x43 cm，有效长度35 cm)为分离通道，60 mmol/L磷酸二氢钠(pH=6.0)乙腈(82)为运行缓冲体系；运行电压 10 kV；进样电压12kV，进样时间30s；在进样之前设定用水冲洗，压力为3.5 kPa，冲洗时间5s紫外检测波长 235 nm。结果：该法使乌头碱的检测灵敏度提高了400倍。乌头碱在37.5~2 4 ×10° ng/mL范围内线性关系良好(r=0.9995)，最低检测限为9.4 ng/mL，平均回收率为97.6%，RSD为 1.9%。结论：本方法简便、快速、专属性强、选择性好、富集效率高，为小活络丸的生产及质量控制提供了一种新的、可靠的分析手段。 中图分类号：R927.1 文献标识码：A 文章编号：1001-1528(2009)10-1543-04 Fast lim it test of trace aconitine in Xaohuoluo Pills ZHANGJian. LIJunmei. JANG Ye (1. Science and Technology General Cam pany， HebeiM edical University， Shijiazhuang 050017， China； 2. Deparmn ent of Analytical Chem isry， Institute ofPhamacy，HebeiM edical University， Shijiazhuang 050017， China) KEY WORD S： field-amplified sample stacking with cap illary electrophoresis； Xiaohuoluo Pills；： aconitine alka-loid； rap id and limited detemm ination ABSTRACT： AM： To establish a cap illary electrophoresis with field-amplified sample stacking method for theseparation and detemm ination of aconitine alkaloid in Xiaohuoluo Pills M ETHOD S： An uncoated fused-silica capi- ( 收稿日期：2008-07-28 ) ( 作者简介：张 剑(1972-)，男，副教授，从事药物的质量研究与质量控制。 ) ( *通讯作者：蒋 晔(1961-)，男，从事药物的质量研究与质量控制。 Tel： (0311)86266069 Email： jiangye@hebmu edu cn ) llary column (50 pm i d X43 cm， effective length 35 cm) was usedThe running buffer was 60 mmol/L phosphate electrolyte solution (pH=6.0)-acetonitrile (82). The ruuning voltage was 10 kV and the cap illary inletwas dipped in water for 5 s with 3. 5 kPa prior to electrokinetic injection (12 kV， 30 s). The detection wavelengthwas 235 nm. FRESULTS：B：This method allowed 400 fold enrichment of aconitine alkaloid. A good linear relationwas obtained in the range of 37. 5~2. 4 ×10'ng/mL (r=0. 999 5)， with the detection lim it of9. 4 ng/mL. Theaverage recovery was 97. 6% with the RSD of 1. 9%. CONCL USDN： The method is siple， rap id， specific andselective with high stacking efficiency； it provides a new reliable means for production and quality control of Xiao-huoluo Pills 小活络丸为一传统的中药制剂，由制川乌、制草乌、胆南星、地龙、乳香(制)、没药(制)等六味中药组成，具有祛风除湿，活络通痹的作用，临床上主要用于治疗风寒湿痹，肢体疼痛，麻木拘挛。方中制川乌和制草乌含有痕量成分乌头碱，现代药理研究证实其具有抗炎、免疫抑制、麻醉止痛、抗肿瘤、降血压等作用。但乌头碱的毒性很强，人口服乌头碱0.2mg即可出现恶心、呕吐、头晕、眼花、脉缓、呼吸困难、神志不清、心律紊乱等中毒现象。然而，由于目前附子没有统一的炮制方法，因此，为控制药品质量，保证用药安全，有必要对小活络丸中痕量毒性成分乌头碱进行质量控制。 目前小活络丸中乌头碱的限量检查主要采用酸性染料比色法21、薄层色谱法3和薄层色谱高效液相色谱法“。酸性染料比色法测定的是药材或制剂中总生物碱的含量，该方法选择性差，线性范围窄，灵敏度低，达不到对乌头碱限量控制的要求。《中国药典》2005年版一部采用薄层色谱法对小活络丸中的乌头碱进行限量检查，该法常用于定性分析，而不适合于痕量毒性成分的限量测定。薄层色谱高效液相色谱法采用薄层色谱法对样品进行分离，高效液相色谱法进行分析，样品预处理繁琐费时，并且由于中药制剂成分复杂，高效液相色谱法对于结构相近的碱性物质的分离难度较大15，6]，因此对样品的预处理及柱效要求较高。本试验建立毛细管电泳(CE)场放大富集技术快速检测小活络丸中痕量乌头碱的方法。该方法将 CE分离度高、样品用量少等优点与场放大富集技术选择性好及适应痕量分析的要求相结合，大大提高了定量分析中的专属性和灵敏度，为小活络丸生产过程中的质量控制及防止药物中毒提供了一种新的、可靠的、方便实用的分析手段。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公 司，中科院研究生院应用化学所)，高压电源(北京彩陆科学仪器有限公司，中科院研究生院应用化学所)，紫外检测器(北京彩陆科学仪器有限公司，中科院研究生院应用化学所)，非涂渍石英毛细管(50um id X43 cm，有效长度35 cm)((河北永年光导纤维厂)。 乌头碱对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号110720-200410)；小活络丸由张家口市德康药业有限公司生产(规格：每丸重3g)(批号20071101，20071202，20071203)。乙腈为色谱纯，所有其它试剂均为分析纯，水为重蒸水。 1.2 电泳条件 运行缓冲溶液为60 mmol/L磷酸二氢钠 (pH=6.0)乙腈(8 ：2)；运行电压12 kV；进样电压10kV，进样时间 30s；在进样之前设定用水冲洗，压力为3.5 kPa，冲洗时间5s紫外检测波长：235nm。开机后毛细管柱用0.1mol/L氢氧化钠溶液冲洗10min，水冲洗 10 m in，运行缓冲溶液冲洗 10 m in，每次进样后用0.1mol/L氧氧化钠溶液、水和运行缓冲溶液分别冲洗 3min。所有溶液在使用前均用0.45um纤维树脂膜滤过。 1.3 对照品溶液的制备 精密称取乌头碱对照品约24mg置100 mL量瓶中，加20%的乙腈使其溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为2.4X10 ug/mL的乌头碱对照品储备液。 1.4 供试品溶液的制备 取本品，研细，取粉末0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加1mol/L盐酸10mL，冰浴超声处理40min，滤过，取续滤液 5 mL，置分液漏斗中，用乙醚洗涤3次，每次10mL，弃去乙醚液，将酸水层用氨水调pH值为9~10，再用乙醚提取3次，每次 10mL，收集乙醚层，挥干，残渣用20%的乙腈溶解，置10mL量瓶中，用20%的乙腈稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。 2 结果与讨论 2.1 CE条件的优化 2.1.11缓冲溶液 pH值的影响 pH值对分离度和迁移时间具有显著影响。本试验对 pH值4.0~8.0进行了考察。结果表明：随着 pH值增加，电渗流增强，迁移时间继而缩短，而当pH值大于6.0时，迁移时间逐渐增加。故选择pH值为6.0 2.1.2 缓冲溶液浓度的影响 离子强度(浓度)主要影响双电层厚度，离子强度越大双电层越薄，电渗降低；同时浓度越大电流越大，其产生的焦耳热也越大，基线噪声提高。本试验考察了缓冲溶液在 40~80 mmol/L浓度范围内，对乌头碱迁移行为及峰形的影响。结果表明：随着缓冲溶液浓度的增大，乌头碱的迁移时间先减小再增大，当缓冲溶液的浓度为60mmol/L时，迁移时间最小，故选择60 mmol/L的磷酸二氢钠作为缓冲溶液。 2.1.3 有机添加剂的影响 有机添加剂主要影响组分的分离选择性和峰形，同时有机添加剂比例增加，迁移时间随之增加。本试验考察了乙乙比例在10%~40%范围内，对乌头碱峰形及迁移行为的影响。结果表明：随着乙腈比例的增加，乌头碱的峰形得到改善，当乙腈比例为20%时，乌头碱的峰形良好。继续增加乙腈比例，迁移时间显著增加，故选择乙腈比例为20%。 22 富集条件的优化 2.2. 1 预进溶液对富集效果的影响 在样品电动进样之前注入一段低电导的溶液塞可以提高富集效果。这是因为施加电压后，低电导的溶液塞所在区带的电场很强，在电动进样时，被分析离子会快速迁移通过低电导的溶液塞，达到分离电解质的界面时因电场强度的显著降低而快速地降低迁移速率，从而使分析物离子在分离前得到有效富集。本试验分别考察了预进水和乙腈对富集效果的影响。结果表明：在上述电泳条件下，预进水和乙腈时，与常规电迁移进样相比，检测灵敏度分别提高400和250倍。故选择水为预进溶液。 22.2 进样时间对富集效果的影响 进样时间的长短主要影响进样量的大小，从而影响富集效果。本试验考察了进样时间在20~40 s范围内，对富集效果的影响。结果表明：随着进样时间的增加，峰高明显增加，在30s之前无减缓趋势，继续增加进样时间，峰高不再增加，峰展宽明显，柱效降低，而不利于定量测定，故选择进样时间为 30 s. 2 2. 3 运行电压对富集效果的影响 在其它试验条件不变的情况下，本试验考察了运行电压在8~16 kV范围内，对富集效果的影响。结果表明：峰高随运行电压的增加而增高，但是随着运行电压的增加，电流增大，焦耳热增加而导致基线噪声提高。当运行电压为12 kV时，乌头碱保留时间适中，峰形良好，故选择最佳运行电压为12kV。 23 线性范围和检出限 在上述优化试验条件下进样分析，对照品溶液和供试品溶液的电泳图如图1所示，小活络丸中其它药材对乌头碱的测定不产生干扰。对一系列乌头碱的对照品溶液进行分析，以其峰面积(Y)对浓度(X： ng/mL)作线性回归，乌头碱在37.5~24×10ng/mL范围内线性关系良好，其线性回归方程为：Y=47.2X- 6.1(r=0.999 5)，检出限(S/N=3)为9.4 ng/mL。 图11乌头碱对照品溶液和供试品溶液的毛细管电泳图A.对照品溶液 B.供试品溶液 1.乌头碱 2.4 重复性和稳定性试验 取同一批(批号20071101)样品5份，按1.4项下方法配制供试品溶液，进样测定，记录电泳图，乌头碱峰面积的 RSD为 2.6%。取同一供试品溶液分别在0、2、4、8、12h进样分析，乌头碱含量的 RSD 为25%，表明供试品溶液在12h内稳定。 2.5 加样回收试验 精密称取同一批(批号20071101)已知含量(乌头碱0.0264mg/丸)的小活络丸(平均片重3.004g/丸)样品粉末约1.00g，分别加入质量浓度为6.00ug/mL的乌头碱对照品的乙腈溶液1.8、1.5和1.2mL各3份，挥干，按 1.4项下方法，自竹1mol/L盐酸 10mL"起操作，并按。1.2项下电泳条件进样，测定乌头碱的含量，计算加样回收率及RSD，测定结果见表1 2.6 样品测定 取3批小活络丸样品，按1.4项下配制供试品溶液，按1.2项下电泳条件进样，记录电泳图，计算 表1 加样回收率试验结果(n=3) 取样量 样品含量 加入量 测得量 回收率平均回收 RSD /g /ug /ug /ug /% 率/% /% 1.01 8.9 10.8 19.6 99.1 1.03 91 10.8 19.8 99，1 97.8 2.2 0.98 8.6 10.8 18.9 95.4 1.03 9.1 9.0 18.0 98.9 0.97 8.5 9.0 17.4 98.9 97.8 2.0 0.97 8.5 9.0 17.1 95.6 1.03 9.1 7.2 16. 1 97.2 0.99 8.7 7.2 15.6 95.8 97.2 1.5 097 8.5 7.2 15.6 98.6 乌头碱的含量，结果见表2。 表2 小活络丸中乌头碱的含量测定结果(n=3) 批号 含量/(mg/丸) RSD/% 20071101 0.0264 1.8 20071202 0.0243 2.2 20071203 0.0267 1.8 乌头碱的提取常采用冷浸法和超声提取法[8]，，但提取的效果不尽相同。由于乌头碱为亲脂性生物碱，并且对热很不稳定，因此本试验利用生物碱的碱性，加酸冰浴超声提取40min 使生成盐溶于水，加乙醚萃取去除脂溶性杂质，再碱化，用乙醚萃取，去除水溶性杂质。该法效果良好，使待测组分不受干扰。同时采用冰浴超声提取既防止成分遇热分解又大大提高了提取效率。 中药制剂成分复杂，阴离子型、阳离子型和中性物质并存，小分子和大分子共存，给分离带来一定的难度。本试验采用毛细管电泳场放大富集技术，基于乌头碱在上述电泳条件下呈阳离子状态，应用电迁移进样，施加正向电压后只对阳离子进行富集，大大减少了药材中阴性和中性共存组分对被测物质的干扰，具有强大的分离选择性及样品净化功能，与高效液相色谱法相比，样品图谱更加简单、精练。并且 本法样品预处理简单、分离效率高、灵敏度高、线性范围宽、实验成本低、环境污染小。乌头碱的检测灵敏度与常规 CE进样相比提高400倍，达到文献报道的高效液相色谱法的水平且有较高的分离能力。该方法的建立为复杂中药制剂的分离和定量测定提供了一种高效、准确的方法，充分显示了其在中药及其制剂分离分析领域的优越性，同时为小活络丸中痕量毒性成分乌头碱的限量检测提供了一种新的、可靠的、方便实用的分析手段。 ( 参考文献： ) ( [1 ] 符华林.我国乌头属药用植物的研究概况[J].中药材， 2004，27(2)：149-152. ) ( [2] 王玉珍，沙明，孔淑萍，等.小活络丸中乌头生物碱的含量 测定和双酯型生物碱的限量检查[J].中成药研究，1988， (6)：1 0 -11 . ) ( [3] 中国药典[S].一部.2005：356-357. ) ( [4] 朱正义，王白露，李君实. 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J Pham B ion ed Anal ， 2006， 40(4)： 1 031- 1 034. ) 红豆杉枝叶可治疗失眠、高血压等疾病 中国中医科学院和章光101集团的研究人员最新发现，红豆杉枝叶可治疗失眠、高血压等疾病。 从红豆杉的根、皮中提取的紫杉醇具有防癌抗癌的作用，因此近年来人工种植红豆杉悄然兴起，而挖掘红豆杉除紫杉醇以外的药用和经济价值也成为热门课题。中国中医科学院和章光101集团的研究人员最新发现，红豆杉枝叶通过闻、嗅的方式可以降低血压、血糖，改善睡眠、疲劳、头晕目眩等症状。 目前，以红豆杉叶为主要原料，利用缓释技术制作的聚能颗粒，已经通过临床试验证明具有明显的降压等效果，显示出产业化的前景。同时，研究人员在对其安全性研究中，尚未发现通过闻香给药对实验动物的不良反应。 嗅法是传统医学中治疗疾病的一种独特方法，早在古医籍中就有“闻(吸)药香”的记载。《中国骨伤》杂志主编、博士生导师董福慧介绍，闻香治疗能激发人体生理潜能，提高人体自身免疫力。目前在疼痛领域，这种方法研究运用较多，在其他领域的研究运用还较少。 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.http：//www.cnki.net