无需手动纯化直接分析合成的寡核苷酸——使用 Agilent InfinityLab 二维液相色谱解决方案进行在 线脱盐和离子对反相液相色谱分析

在分子生物学和分子诊断中，聚合酶链式反应 (PCR)、基因沉默以及相关技术1 都需要标准的和经修饰的合成寡核苷酸。此外，合成寡核苷酸在作为治疗剂治疗各种疾病（例如癌症和病毒性疾病）方面的重要性日益突显2。寡核苷酸类药物包括反义寡核苷酸、小干扰 RNA (siRNA) 和适配体。反义寡核苷酸和 siRNA 均通过阻止 mRNA 翻译从而阻止蛋白质合成。适配体通过形成适配体-蛋白质复合物，从而抑制蛋白质的生物学功能3。寡核苷酸通常通过亚磷酰胺化学法合成2,4。可获得的纯度通常大于 70%，合成后存在的常见杂质包括缺失或增加序列的寡核苷酸连同未完全去保护的产物、缺失嘌呤碱基的寡核苷酸以及其他降解产物2。通常使用离子对反相液相色谱 (IP-RPLC) 和阴离子交换色谱对合成的去保护寡核苷酸进行分析分离与纯化2,4。阴离子交换纯化馏分通常含有高浓度的盐，如氯化钠 (NaCl) 或溴化钠 (NaBr)。当使用 IP-RPLC 对这些馏分进行分析时，高浓度的盐会削弱寡核苷酸参与离子配对的能力，从而导致保留时间变化、峰分裂以及峰流穿5。为了对阴离子交换纯化馏分进行成功的 IP-RPLC 分析，需要在分析前对样品进行脱盐5，而这一过程通常手动完成。本应用简报展示了高盐浓度溶液中寡核苷酸的直接二维液相色谱分析，这一盐浓度与寡核苷酸合成后阴离子交换纯化馏分中的盐浓度相当。二维液相色谱分析的第一维用于在线脱盐，随后在第二维中进行IP-RPLC 分析。在该设置中，二维液相色谱的使用可以节省时间并避免手动的样品前处理步骤。省去手动样品前处理步骤可以提高重现性，且可以避免样品前处理过程中的样品损失。