从冻存的细胞提取RNA操作步骤

从冻存的细胞提取RNA1). 将冻存管从液氮或冰箱中取出；2). 不待细胞溶解，将Trizol500ul-1ml直接放入冻存管中，此时Trizol会冻成冰状；3). 将冻存管缓慢融化，并用加样器吹打混匀；4). 将细胞裂解液移至Eppendorf管中，16000′g离心1min，吸出管底絮状沉淀;注释：该步骤并非必要，多数Protocol省略该步骤，但加入该步中能明显提高RNA的质量；注意不能离心时间过长，否则沉淀难以吸出，将200ul黄枪头尖部切去0.5cm操作；5). 加入1/5体积的氯仿（约200ul）,上下颠倒2~3min；6). 4℃ 16000′g离心15min，轻轻吸出上清至新的Eppendorf管（约700ul ），不要扰动中间层或用手指使Eppendorf管变温；注释：一般情况下提取的RNA已经足够，而且在逆转录过程中RNA的质量要远较RNA的数量更重要，一般仅取上清的上1/2左右足矣，这样可最大限度避免对于中间蛋白相的扰动；7). 加入等体积异丙醇（约800ul）,充分混匀，冰上静置15min；8). 4℃ 16000′g离心15min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；9). 加入1ml预冷的无水乙醇，4℃ 16000′g离心2min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；10). 倒置Eppendorf管于干净滤纸上，至可见乙醇完全挥发；11). 用100ul 新鲜制备的DEPC处理过的MilliQ 水溶解RNA，如果溶解不好，-20℃反复冻融1~2次，4℃ 16000′g离心3min，将上清吸至新的Eppendorf管中；12). 加入等体积12 M LiCl，-20℃静置15min；13). 4℃ 16000′g离心15min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；注释：该步骤的目的在于去除小分子降解RNA和盐分；但可以省略；只有大分子RNA在高浓度LiCl中沉淀，DNA不会沉淀；14). 加入1ml预冷的无水乙醇，4℃ 16000′g离心2min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；注释：该步的目的在于去除LiCl，LiCl溶于乙醇，而RNA不溶于乙醇，利用溶解度分离；15). 倒置Eppendorf管于干净滤纸上，至可见乙醇完全挥发RNA边缘呈半透明；16). 用40ul新鲜制备的DEPC处理过的MilliQ 水溶解RNA；17). 取出5ul 用于紫外分光光度计测定和琼脂糖凝胶电泳，其余冻存-70℃。注释：如果OD260/OD280＜1.8，则加入等体积Trizol，按上述步骤重新提纯。