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外源DNA片断中PCR扩增产物的克隆检测产品配置单(离心机)

  • 应用领域: 生物产业
  • 检测样品: 外源DNA片断
  • 检测项目:PCR扩增产物的克隆
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  • 发布时间:2019-02-18
  • 参考标准:PCR扩增产物的克隆—TA克隆法
实验方法原理 TA克隆 系统由Invitrogen公司(San Diego,CA)发展而来的商业性试剂盒,它用于PCR 产物的克隆 和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR 产物的3'末端加上一个非模板依赖的A,而T载体是一种带有3'T突出端的载体,在连接酶作用下,可以快速地、一步到位地把PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆 位点(MCS)中。 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种:T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。 T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步:首先,T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物;然后,酶-ATP复合物再结合到具有5'磷酸基和3'羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化;最hou产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点,所以切割时出现两种可能,一种是单酶切,另一种是双酶切,这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说,载体与供体的末端都相同,连接可以在任何末端之间进行,这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底,可对载体进行5'除磷酸处理,原理是连接酶只能连接DNA片断的3'OH末端与5'端,所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时,由外源片断提供5'端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。对于双酶切来说,无论载体与供体同一片段上都有不同的末端,这样就避免了载体与供体的自环,能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),这样既可最da限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR产物,其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基,可以与pGEM-T Easy Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。
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PCR扩增产物的克隆—TA克隆法

 

实验方法原理

TA克隆 系统由Invitrogen公司(San DiegoCA)发展而来的商业性试剂盒,它用于PCR 产物的克隆 和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR 产物的3'末端加上一个非模板依赖的A,而T载体是一种带有3'T突出端的载体,在连接酶作用下,可以快速地、一步到位地把PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆 位点(MCS)中。

 

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种:T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

 

T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步:首先,T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物;然后,酶-ATP复合物再结合到具有5'磷酸基和3'羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化;最hou产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点,所以切割时出现两种可能,一种是单酶切,另一种是双酶切,这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说,载体与供体的末端都相同,连接可以在任何末端之间进行,这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底,可对载体进行5'除磷酸处理,原理是连接酶只能连接DNA片断的3'OH末端与5'端,所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时,由外源片断提供5'端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。对于双酶切来说,无论载体与供体同一片段上都有不同的末端,这样就避免了载体与供体的自环,能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。

 

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),这样既可最da限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR产物,其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基,可以与pGEM-T Easy Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。

 

 

实验材料: 外源DNA片断

 

试剂、试剂盒:pMD 18-T Vector    Ligation buffer     T4 ligatease    rATP

 

仪器、耗材:超净工作台 离心机 恒温摇床 恒温培养箱 培养皿 试管 离心管 电泳仪 电泳槽 凝胶样品梳 移液器

 

实验步骤:

 

一、大肠杆菌感受态细胞的制备

 

1.  取大肠杆菌JM109保存液50 ul,接种于4 ml LB(或SOB)液体培养基中,37℃300 rpm振荡培养过夜,第二天取50 ul 转接到新的4 ml LB(或SOB)液体培养基中扩大培养3 hOD600=0.350.4,在无菌操作台上取1 ml菌液于1.5 ml离心管中,冰浴10 min

 

2.   4℃5 000 rpm离心2 min,去上清液。

 

3.  加入750 ul预冷的0.1 M CaCl2重悬菌体,冰浴30 min

 

4.   4℃5 000 rpm离心2 min,弃上清液。

 

5.  加入100 ul 冰冷的0.1 M CaCl2轻轻重悬菌体,冰浴2 h后,4℃保存备用。

 

二、重组DNA的转化

 

1.  将含AmpX-GalIPTGLB平板37℃预热。

 

2.   100 ul感受态细胞中加入10 ul连接产物,冰浴30 min

 

3.  将离心管转入42℃水浴,热冲击90秒,然后不要摇动离心管,迅速将其放在冰上2 min

 

4.  在离心管中加入SOC培养基300 ul,枪头混匀,37℃150 rpm温和摇振60 min

 

5.  200 ul 转化菌液均匀地涂布于含50 mg/ml Amp20 mg/ml X-gal200 mg/ml IPTG LB平板上,37℃倒置培养过夜,挑选白色菌落进行鉴定。

 

三、重组质粒的鉴定

 

方案一: 菌落PCR

 

1) 制备PCR混合液。

 

2) 用经灭菌的10 ul 枪头(不用牙签)挑去白色菌落,迅速地使挑取物溶在上述混合液中。

 

3) 盖上离心管得盖子,在沸水上温育10 min

 

4) 将步骤的样品冷却至室温,离心数秒,然后于管中加入TaKaRa rTaq0.25 ul

 

5) 按以下条件进行PCR反应:94℃预变性3 min;然后进行30个循环反应,其温度循环条件为:94℃变性1 min57℃退火1 min72 ℃延伸1 min;循环结束后72℃再延伸5 min

 

6) 取5 ul PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

 

方案二: 质粒PCR

 

1.  碱裂解法少量制备质粒DNA

 

1)用离心管收集4 mlLB培养基(含Amp)中培养过夜的菌液,14 000 rpm离心30秒,弃尽上清。

 

2)用250 ul 已加入RNase A1Buffer S1充分悬浮细菌沉淀。

 

3)加入250 ul Buffer S2,温和但充分地上下翻转混合4-6次,此步骤不宜超过5 min*Buffer S2使用后应立即盖紧瓶盖,以免空气中的CO2中和Buffer S2中的NaOH,降低溶菌效率。

 

4)加入400 ul Buffer S3,温和地上下翻转8-10次,室温静置2 min14 000 rpm离心10 min

 

*若离心后凝结块未沉淀到离心管底部,应再上下翻转数次,12000g离心3min

 

5)将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中,将步中的混合液移入DNA-prep Tube中,5 500 rpm离心1 min

 

6) 弃滤液,将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中,加入500 ul Buffer W15500 rpm离心1 min

 

7)弃滤液,将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中,加入700 ul 已加无水乙醇的Buffer W25 500 rpm离心1 min,以同样的方法再用700 ul已加无水乙醇的BufferW2洗涤一次。

 

8) 弃滤液,将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中,14 000 rpm离心1 min

 

9)连滤液一并弃掉收集管,将DNA-prep Tube 置于一新的1.5 ml 离心管中,在silica 膜中央加入25-30 ul Eluent或去离子水。

 

10)室温静置2 min14 000 rpm离心1 min洗脱DNA

 

11) 取5 uL样品,1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。

 

2.  抽提纯化质粒DNA酚、氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的质粒DNA中残留的蛋白质。

 

1) 加TE稀释质粒DNA溶液至300 uL

 

2)加等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),震荡混匀,静置3 min

 

314 000 rpm 离心5 min,吸上清液,加等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),混匀,静置3 min

 

4 14 000 rpm离心5 min,吸上清液,加等体积的氯仿:异戊醇(24:1),混匀,静置3 min

 

5 14 000rpm离心5 min,吸上清液,加2.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀后-20℃放置15 min,沉淀质粒DNA

 

6 14 000rpm离心13 min,弃上清液,沉淀加入200 uL 70%乙醇洗涤一次,室温干燥,用20 uL去离子双蒸水溶解质粒DNA沉淀,-20℃保存待用。

 

7) 取5 ul样品,1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。

 

3.  质粒PCR

 

1 PCR反应体系如下:

 

2PCR 扩增反应条件:94℃预变性3 min;然后进行30 个循环反应,其温度循环条件为:

 

94℃变性1 min57℃退火1 min72 ℃延伸1 min;循环结束后72℃再延伸5 min

 

3) 取5 ul PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测,方法与试验二相同。

 

 

注意事项:

 

1.  要获得目的基因的TA克隆 ,PCR 产物的特异性要好。

 

2.  PCR 产物在TA克隆 前要通过纯化。

 

3.  PCR 产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。

 

4.   制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作,同时注意近火无菌操作,防止感受态细胞受杂菌污染。

 

5.  42℃热处理时很关键,转移速度要快,且温度要准确。

 

6.   菌液涂皿操作时,应避免反复来回涂布,因为感受态细菌的细胞壁有了变化,过多的机械挤压涂布会使细胞破裂,影响转化率。

 

8.  Ligation Solution I 请于冰中融解。

 

9.  在进行克隆时,Vector DNAInsert DNA的摩尔比一般为:1: 2 ~ 10。在本制品中, pMD18-T Vector1 ml (50 ng) 的摩尔数约为0.03 pmolControl Insert DNA 1ml (50 ng) 的摩尔数约为0.15 pmol

 

10.  克隆时使用的Insert DNA片段 (PCR 产物) 尽量进行切胶回收纯化,PCR产物中的短片段DNA(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响TA克隆的效率。

 

11.  按照本实验操作进行连接后,直接进行转化时的连接液不要超过20 ml。当进行转化的DNA用量较大或准备进行电转化时,需对连接液进行乙醇沉淀,纯化DNA后再进行转化。

 

12.   连接反应请在16℃下进行,温度升高 (>26℃) 较难形成环状DNA

 

13.   连接效率偏低时,可适当延长连接时间至数小时。

 

14.   感受态细胞可使用适合于pUC系列载体的感受态细胞,如:JM109DH5a等。

 

其他问题:

一、常见问题

 

1.  怎样提高pMD18-T Vector的克隆效率?

 

1) 纯化PCR产物,切胶回收的PCR片段最好。

 

2)除去残存的引物等杂质。

 

3DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下,大片段DNA的克隆效率(连接效率与转化效率)小于短片段DNA,在使用大片段DNA的连接液进行转化时,建议采用电转化方法。

 

 

2.  PCR产物难以插入载体,为什么?

 

1)确认PCR反应使用的DNA聚合酶在PCR产物的3'端是否附加了"A"。有些DNA聚合酶扩增的PCR产物是平端,如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005)等扩增得到的PCR产物不能直接用于TA克隆;PCR产物保存时间不要过长,长时间保存的PCR产物会脱去末端的"A"碱基。

 

2PCR产物中短片段杂质DNA太多,这时应切胶回收纯化DNA片段,回收时PCR产物不要在紫外线下暴露时间过长。

 

3)确认感受态细胞的转化效率,使用的感受态细胞的转化效率最好大于108 cfu/mg pUC118 DNA

 

4)确认Ligation Solution I 的连接效率是否降低,多次反复冻融会降低的Ligation Solution I 连接效率。

 

5)确认抗生素的浓度是否过大。

 

6)最好使用新配制的平板培养基。

 

3.  转化后的菌落全为蓝色 (或淡蓝色),为什么?

 

插入的PCR片段较短(小于500 bp),且插入片段没有影响lacZ基因的读框时,平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色。

 

4.  插入的PCR产物进行测序时,可使用何种引物?

 

本制品的载体来源于pUC18载体。因此,用于pUC18载体测序的引物都可以使用。

 

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