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mRNA中分离纯化检测产品配置单(抗体 试剂盒)

  • 应用领域: 生物产业
  • 检测样品: mRNA
  • 检测项目:分离纯化
  • 浏览次数:14 次
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  • 发布时间:2019-05-24
  • 参考标准:mRNA分离纯化
目前常用的mRNA的纯化方法有: (1)寡聚(dT)-纤维素柱层析法,即分离mRNA的标准方法; (2)寡聚(dT)-纤维素液相离心法,即用寡聚(dT)-纤维素直接加入到总的 RNA溶液中并使mRNA与寡聚(dT)-纤维素结合,离心收集寡聚(dT)-纤维素/mRNA复合物,再用洗脱液分离mRNA,然后离心除去寡聚(dT)-纤维素; (3)其它一些方法:如寡聚(dT)-磁性球珠法等。 本实验应用方法(1)进行mRNA的分离纯化。 【试剂与器材】 (一)试剂 1. 0.1mol/L NaOH ,每组200mL 2. 寡聚Oligo(dT)-纤维素 3. 加样/洗涤缓冲液1:0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组250mL 或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。 4. 洗涤缓冲液2:0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。 配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,经高压消毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至65℃时,加入经65℃温育(30min)的10%SDS至终浓度。 5. 5 mol/L NaCl,每组10mL 6. 3 mol/L NaAc pH5.2,每组10mL 7. 无RNase双蒸水(DEPC水),每组100mL 8. 70%乙醇,每组10mL 注意:溶液5,6的配制都应该加0.1% DEPC处理过夜,溶液1,3,4,8则用经0.1% DEPC处理过的无RNase双蒸水配制,Tris应选用无RNase的级别。溶液配制后,最hao能够按一次实验所需的分量分装成多瓶(如10ml或50ml/瓶)保存,每次实验只用一份,避免多次操作造成对溶液的污染。
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      真核生物的mRNA分子是单顺反子,是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物,因此,高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1x10-5?g RNA,理论上认为每克细胞可分离出510mg RNA。其中 rRNA75%~ 85%,tRNA10%~16%,而mRNA仅占1%5%,并且mRNA分子种类繁多,分子量大小不均一,表达丰度也不一样。
      
真核生物mRNA有特征性的结构,即具有5’端帽子结构(m7G)和3’端的poly(A)尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20~300个腺苷酸组成的polyA)尾,通常用polyA+)表示,这种结构为真核mRNA分子的提取、纯化,提供了极为方便的选择性标志,寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。
      
一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3’ 末端含有多poly(A)尾巴结构特性设计的。当总RNA流经寡聚(dT)(即oligo(dT))纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,经过两次oligo(dT)纤维素柱,即可得到较纯的mRNA
目前常用的mRNA的纯化方法有:
1)寡聚(dT)-纤维素柱层析法,即分离mRNA的标准方法;
2)寡聚(dT)-纤维素液相离心法,即用寡聚(dT)-纤维素直接加入到总的 RNA溶液中并使mRNA与寡聚(dT)-纤维素结合,离心收集寡聚(dT)-纤维素/mRNA复合物,再用洗脱液分离mRNA,然后离心除去寡聚(dT)-纤维素;
3)其它一些方法:如寡聚(dT)-磁性球珠法等。
本实验应用方法(1)进行mRNA的分离纯化。
【试剂与器材】
(一)试剂
1
0.1mol/L NaOH ,每组200mL
2
. 寡聚OligodT-纤维素
3
. 加样/洗涤缓冲液10.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组250mL
0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS
4
. 洗涤缓冲液20.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组250mL10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS
配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)NaClEDTApH 8.0)的母液,经高压消毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至65℃时,加入经65℃温育(30min)的10%SDS至终浓度。
5
5 mol/L NaCl,每组10mL
6
3 mol/L NaAc pH5.2,每组10mL
7
. 无RNase双蒸水(DEPC),每组100mL
8
70%乙醇,每组10mL
注意:溶液56的配制都应该加0.1% DEPC处理过夜,溶液1348则用经0.1% DEPC处理过的无RNase双蒸水配制,Tris应选用无RNase的级别。溶液配制后,最hao能够按一次实验所需的分量分装成多瓶(如10ml50ml/瓶)保存,每次实验只用一份,避免多次操作造成对溶液的污染。
(二)器材
1
. 恒温水浴箱
2
. 冷冻高速离心机
3
. 紫外分光光度计
4
. 巴斯德吸管
5
. 玻璃棉
6
5ml一次性注射器

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