LC-MS/MS分析畜禽养殖废弃物中的磺胺类、喹诺酮类以及四环素类抗生素残留

本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪和三重四极杆质谱仪联用测定测定养殖废弃物中喹诺酮类、磺胺类、四环素类兽药残留量的方法。喹诺酮类、磺胺类、四环素类的校准曲线线性范围在0.5~200 μg/L间，相关系数0.995以上。在猪粪基质中添加低、中、高三个浓度（25、50、100 μg/kg）的混标，添加回收率在83-108%之间，RSD不超过7.6%。该方法具有分析速度快、重复性好、灵敏度高的特点，适合畜禽养殖废弃物中喹诺酮类、磺胺类、四环素类抗生素的残留的检测。SSL-CA22-542Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-727 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS 分析畜禽养殖废弃物中的磺胺类、喹诺酮类以及四环素类抗生素残留 LCMSMS-727 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪和三重四极杆质谱仪联用测定养殖废弃物中喹诺酮类、磺胺类、四环素类兽药残留量的方法。样品经过 EDTA-Mcllvaine 提取液、甲醇提取，正己烷除脂后，旋蒸浓缩。复溶液经 HLB小柱净化，上机测定。采用多反应监测模式(MRM)测定，外标法绘制校准曲线。喹诺酮类、磺胺类、四环素类的校准曲线线性范围在0.5~200 ug/L间，相关系数0.995以上。在猪粪基质中分别进行低、中、高三个浓度(25、50、100 ug/kg) 的添加回收试验，每个加标浓度重复6次，添加回收率在 83-108% 之间，相对标准偏差不超过7.6%。该方法具有分析速度快、重复性好、灵敏度高的特点，适合畜禽养殖废弃物中喹诺酮类、磺胺类、四环素类抗生素的残留的检测。 关键词：三重四极杆液质联用仪喹诺酮磺胺 四环素 养殖废弃物 技术特点： 小根据在研法规趋势，开发了养殖废弃物中34种兽药残留同时分析方法。 抗生素在动物体内不能被完全吸收，约60-90%会随动物粪便排出。有机肥以畜禽粪便为主要肥源，一般未经处理或简单堆驱后即施加到土壤中。在土壤中较为稳定，过量的抗生素进入环境中，对农田土壤、地表和地下水及生态系统中各类生物产生危害，并诱发和传播各类抗生素耐药细菌，对人类公共健康产生威胁。有研究表明，磺胺类、四环素类和喹诺酮类抗生素是畜禽养殖中最为常用的几种抗生素。国家已颁布《GB/ T 32951-2016有机肥料中土霉素、四环素、金霉素与强力霉素的含量测定高效液相色谱法》来监控其在有机肥中的含量，但其覆盖的抗生素种类少，无法实现全面的抗生素监测研究。 本文参考该标准，使用岛津超快速液相色谱仪 LC-20AXR和三重四极杆质谱仪LCMS-8045联用，建立了测定养殖废弃物中34种兽药残留量的方法，此方法快速、简单、选择性强和灵敏度高，供相关检测人员参考。 1.1仪器配置 岛津超高效液相色谱与三重四极杆质谱仪联用系统 LCMS-8045。具体配置为： 输 液 泵：：LC-40D XR×2 系 统控空制器 CBM-40 自动进样器：SIL-40C XR 三重四极杆质谱仪：LCMS-8045 柱 温 箱：CTO-40C 色谱 工作 站： LabSolutions Ver. 5.113 1.2分析条件 液相色谱条件 色 谱 柱：：Shim-pack GIST C18(100 mmx2.1mml.D.，2.0 um) 岛津(上海)实验器材有限公司， P/N： 227-30001-04 动 相： A相-0.1%甲酸水溶液；B相-乙腈 流流速0.3 mL/min进样量：55uL柱温40℃洗针模式：7水：乙腈(1：1) 洗脱方式： 梯度洗脱，B相初始浓度为10%，时间程序见表1。 表1 梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 0.50 Pumps Pump B Conc. 10 3.00 Pumps Pump B Conc. 30 9.10 Pumps Pump B Conc. 60 10.00 Pumps Pump B Conc. 90 11.10 Pumps Pump B Conc. 10 15.00 Controller Stop 质谱条件 质谱仪：LLCMS-8045脱溶剂管温度：250℃离子源：EESI+4.5 kV加热模块温度：400℃雾化气：舞氮气3L/min接口温度：300°℃干燥气：舞氮气 10 L/min扫描模式：MRM加热热气：空气 10 L/minMRM参数：见表2 表2 MRM 参数 编号 化合物名称 保留时间]((min) 前体离子 产物离子 01 Pre Bais(V) CE(V) Q3 Pre Bais(V) 1 321.20 303.10* -16 -20 -23 依诺沙星 5.93 203.90 -16 -48 -23 318.20* -30 -18 -24 2 氧氟沙星 5.90 362.20 261.10 -30 -28 -19 302.10* -16 -20 -23 3 诺氟沙星 6.14 320.20 231.10 -16 -46 -28 4 培氟沙星 5.93 334.20 316.20* -13 -20 -24 290.10 -13 -16 -22 5 6.33 332.20 314.10* -13 -16 -24 环丙沙星 231.00 -13 -44 -18 6 洛美沙星 6.58 352.20 265.00* -18 -22 -20 308.20 -18 -16 -23 7 6.45 358.20 340.10* -14 -20 -26 达氟沙星 255.00 -14 -42 -29 8 6.41 360.30 342.20* -29 -20 -26 恩诺沙星 316.20 -29 -20 -24 9 7.01 386.20 368.10* -15 -20 -28 沙拉沙星 299.10 -15 -25 -23 10 双氟沙星 6.77 400.00 356.00* -17 -20 -25 299.00 -17 -29 -28 11 司帕沙星 7.78 393.00 349.00* -30 -21 -24 292.00 -30 -21 -24 12 磺胺醋酰 3.58 215.00 156.00* -23 -10 -29 92.00 -23 -23 -17 34 三甲氧苄胺嘧啶 5.41 291.10 230.20* -20 123.20 -20 -25 *定量离子对 1.3标准品及试剂 34种兽药混标溶液：磺胺类19种、四环素类4种、喹诺酮类11种购自天津阿尔塔科技有限公司，浓度均为 100 mg/L； 试剂耗材： InertSep HLB 固相萃取小柱 (SHIMADZU SGLC P/N：5010-81976)，室温保存。正己烷：色谱纯； 甲醇：色谱纯，室温保存； 乙腈：色谱纯，室温保存； 实验用水：由 Milli-Q Plus 水净化系统经去离子与二次净化制得； 甲酸：色谱级，纯度98%，室温保存； Mcllvaine 溶液：将0.2M磷酸氢二钠溶液与0.1M柠檬酸溶液按体积比5：8混合； NazEDTA-Mcllvaine 提取液 ： c(NazEDTA-Mcllvaine)=0.1M。称取37.2g二水乙二胺四乙 酸二钠 (Naz-EDTA·2H20) 于1LMcllvaine 溶液中，用 HCI或 NaOH 调至 pH 4.0。 1.4样品制备 样品前处理方法：称取试样0.5g~1g(精确至0.001 g) 置于50mL离心管中，加入 EDTA-Mcllvaine提取液 10mL， 涡旋混匀，再加入10mL甲醇，涡旋混匀，常温超声15 min， 在4℃下8000 r/min 离心 15min， 上清液转移至另外棕色容器中，重复提取一次，合并提取液，加入10mL正己烷去脂后，过 0.45 um 微孔滤膜，将过膜后液体在旋转蒸发仪(水浴温度不超过40℃为宜)旋蒸至3mL~5ml，用于净化。 HLB 固相萃取柱使用前依次用5mL甲醇和10mL水活化。将以上提取液以 3 mL/min~5 mL/min 流速过柱，用 5 mL 的15%甲醇溶液淋洗 HLB固相萃取柱并抽干，用 10 mL 的65%甲醇溶液洗脱目标抗生素，洗脱液于旋转蒸发仪旋蒸至0.1mL以下，用甲醇溶液定容至1mL， 过 0.22um膜，上机待测。 基质匹配标准溶液配制：不含34种兽药的空白样品按照上述方法处理，制备出空白基质。称取适量34种标准物质，用甲醇配制 100 mg/L 的混合标准储备溶液；用空白基质将混合标准储备溶液稀释成浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ug/L的基质混合标准工作液。 结果与讨论 2.1标准样品色谱图 11种喹诺酮类、19种磺胺类以及4种四环素类兽药在9 min 实现了良好的分离，峰形对称无干扰。10 pg/L标准溶液如下图1所示。 (x100，000) 图1 标准样品的 MRM色谱谱图图((10ug/L) (1.依诺沙星、2.氧氟沙星、3.诺氟沙星、4.培氟沙星、5.环丙沙星、6.洛美沙星、7.达氟沙星、8.恩诺沙星、9.沙拉沙星、10.双氟沙星、11.司帕沙星、12.磺胺醋酰、13.磺胺嘧啶、14.磺胺噻唑、15.磺胺吡啶、16.磺胺甲基嘧啶、17.磺胺二甲嘧啶、18.磺胺甲氧哒嗪、19.磺胺氯哒嗪、20.磺胺甲噁唑、21.磺胺二甲基异噁唑、22.磺胺间二甲氧嘧啶、23.磺胺喹噁啉、24.磺胺甲噻二唑、25.磺胺间甲氧嘧啶、26.磺胺邻二甲氧嘧啶、27.磺胺对甲氧嘧啶、28.磺胺苯酰、29.磺胺苯吡唑、30.土霉素、31.四环素、32.金霉素、33.强力霉素、34.三甲氧苄胺嘧啶) 2.2线性及灵敏度 将 0.5-200 ug/L 不同浓度的猪粪基质匹配标准工作液按1.2中的分析条件进行测定，外标法定量。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线如图2所示(篇幅有限，仅显示部分化合物)；所得校准曲线线性关系良好，相关系数 r>0.999。根据信噪比 S/N=3、S/N=10计算检出限(LOD)、定量限(LOQ)， LOD 为 0.03~1.41ug/kg， LOQ 为 0.09~4.29 ug/kg。 如下表3 图2 校准曲线 表3线性方程及灵敏度 抗生素名称 校准曲线 线性范围(ug/L) 相关系数r 检出限(ug/kg) 定量限(ug/kg) 依诺沙星 Y=66861X-4082 1-100 0.9999 0.11 0.34 氧氟沙星 Y=61646X-1677 1-100 0.9992 0.04 0.13 2.2加标回收率 在鲜猪粪中进行低、中中、高三个浓度(25、50、100 pg/kg) 的添加回收试验，每个加标浓度重复6次，加标回收率如下表4所示。添加回收率在83~108%之间，相对标准偏差 (RSD) 不超过 7.6%。 表4 猪粪加标回收率 结论 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪和三重四极杆质谱仪联用测定测定养殖废弃物中喹诺酮类、磺胺类、四环素类兽药残留量的方法。喹诺酮类、磺胺类、四环素类的校准曲线线性范围在0.5~200 ug/L间，相关系数 0.995 以上。在猪粪基质中添加低、中、高三个浓度 (25、50、100 ug/kg) 的混标，添加回收率在83-108%之间， RSD 不超过 7.6%。该方法具有分析速度快、重复性好、灵敏度高的特点，适合畜禽养殖废弃物中喹诺酮类、磺胺类、四环素类抗生素的残留的检测 本文研究内容已正式发表，完整内容请参考文献 ( 1韩岩松，郑锌，黄均明，保万魁，刘红芳，刘蜜，王旭.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定畜禽粪便中34种抗生素含量[J]. 中国土壤与肥料，2022(02)：216-229. ) 岛津应用云