饲料中海南霉素检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA20-658Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-581 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS测定饲料中海南霉素 LCMSMS-581 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定饲料中海南霉素的方法，该方法可在8.0 min 内完成对目标物的检测。海南霉素在50.0 ng/mL~5000.0 ng/mL 浓度范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r在0.999以上，且精密度和回收率实验结果均符合标准要求。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，可用于饲料中海南霉素的快速检测。 关键词：三重四极杆质谱饲料海南霉素 海南霉素是从我国海南岛土壤中分离的一种稠李链霉菌东方变种，培养液中提取的聚醚类抗生素，是我国20世纪80年代自主研发并审批通过的第一个一类新兽药。它对革兰氏阳性菌有抑制作用，对革兰氏阴性菌效果较差，主要用来预防和治疗家禽球虫病和作为牛羊等家畜的饲用促生长剂使用。然而，毒理学研究表明海南霉素具有一定的毒性作用，如服用含高浓度海南霉素饲料会影响动物采食和导致瘫痪，更会导致动物食品中药物残留。农业部公告第168号《饲 料药物添加剂使用规范》附录1中明确规定，海南霉素用于鸡球虫病，每1000 kg饲料中可添加海南霉素500-750g，但蛋鸡产蛋期禁用。 本文参照农业农村部公告第197号-4-2019《饲料中海南霉素的测定液相色谱-串联质谱法》，建立了使用 LCMSMS 测定饲料中海南霉素的测定方法。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，可用于饲料中海南霉素的快速检测。 1.1仪器 本实验使用超高效液相色谱仪 LC-40 X3与三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用系统。 具体配置为： 系统控制器： CBM-40自动进样器：SIL-40C X3输液泵： LC-40B X3 ×2质谱仪： LCMS-8045柱温箱：CTO-40S色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.99 SP2 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack Velox C18 (100mm×2.1 mm l.D.， 2.7um， SGLC， P/N： 227-32009-03) 流动相：A相-乙酸铵溶液(1mmoL/L)；EB相-甲醇，时间程序见表1。 流速：0.40 mL/min 柱温：40℃ 进样体积：2.0uL 洗脱方式：梯度洗脱，初始浓度为 B 相60% 表1 梯度洗脱程序 Time Module Command Value 1.00 Pumps Pump B Conc. 60 2.00 Pumps Pump B Conc. 95 6.00 Pumps Pump B Conc. 95 6.10 Pumps Pump B Conc. 60 8.00 Controller Stop 质谱条件 离子源：ESI，正离子模式 DL管温度：250℃ 离子源接口电压：4.0kV 加热模块温度：400℃ 雾化气氮气 3.0 L/min 接口温度：300℃ 干燥气：氮气10 L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 加热气：空气10 L/min MRM参数：见表2 碰撞童：氩气(230kPa) 驻留时间：147 msec 表2 MRM 参数 化合物名称 监测离子对 Q1 pre (V) CE Q3 Pre(V) 海南霉素 907.30>845.25* -34.0 -25.0 -30.0 907.30>863.40 -34.0 -40.0 -30.0 注：*表示定量离子对 1.3标准溶液的配制 准确称取10 mg 海南霉素标准品，用乙腈配制1.0 mg/mL标准物质溶液，置于冰箱中-20℃保存，有效期12个月。 1.4样品前处理方法 图1样品前处理流程图 结果与讨论 2.1标准样品的MRM 色谱图 图2：基质标准曲线中50ng/mL标准品 MRM 色谱图 2.2线性范围与检出限 取空白饲料样品溶液六份，添加海南霉素标准物质工作液，使其浓度分别为50 ng/mL、100 ng/mL、200ng/mL、1000 ng/mL、5000 ng/mL， 作为添加样品，与检材样品平行操作。以待测物特征离子峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，外标法绘制标准曲线。如图3所示，所得校准曲线线性关系良好，线性方程及相关系数见表3。 图3海南霉素校准曲线 表3 标准曲线与检出限信息 化合物 R 线性范围(ng/mL) 检出限(ug/kg) 准确度，% 海南霉素 0.9999 50.0~5000.0 2.47 94.37-104.73 2.3精密度 对浓度为100 ng/mL的海南霉素标准工作液连续测定6次，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如表4所示。结果显示：保留时间和峰面积的 RSD分别为 0.20%和2.51%，仪器精密度良好。 表4保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 项目 保留时间 (min) 峰面积 1 5.246 70341 2 5.252 70091 3 5.262 66747 4 5.271 71870 5 5.242 71153 6 5.254 69955 RSD(%) 0.20 2.51 2.4回收率 称取空白饲料样品，加入海南霉素标准溶液，使加标浓度为0.125 mg/kg。按照1.4样品前处理方法提取净化后，测定海南霉素的加标回收率。空白饲料样品和加标饲示样品 MRM 色谱图如图4所示，3个平行样品的加标回收率均值为99.50%， RSD 为5.70%。 图4 空白饲料样品和加标浓度为 0.125 mg/kg 饲料样品 MRM色谱图 结论 本文参照农业农村部公告第197号-4-2019《饲料中海南霉素的测定液相色谱-串联质谱法》，建立了一种使用 LCMSMS 测定饲料中海南霉素的方法，该方法可在 8.0 min 内完成对目标物的检测。海南霉素在50.0 ng/mL~5000.0 ng/mL浓度范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r在0.999以上，保留时间和峰面积的RSD 分别为 0.20%和2.51%，仪器精密度良好。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，可用于饲料中海南霉素的快速检测。岛津应用云 本文参照农业农村部公告第197号-4-2019《饲料中海南霉素的测定 液相色谱-串联质谱法》，建立了一种使用LCMSMS测定饲料中海南霉素的方法，该方法可在8.0 min内完成对目标物的检测。海南霉素在50.0 ng/mL~5000.0 ng/mL浓度范围内线性良好，校准曲线线性相关系数r在0.999以上，保留时间和峰面积的RSD分别为0.20%和2.51%，仪器精密度良好。该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，可用于饲料中海南霉素的快速检测。