食品中叶酸含量检测方案(液相色谱仪)

Acchrom·Tech华谱科仪 400-108-7908(售后) 叶酸(folic acid) 是一组含有碟酰谷氨酸结构的一类化合物统称。食物中的叶酸绝大多数是以喋酰多谷氨酸(或称多谷氨酸叶酸)的形式存在的。目前《GB5009.211-2014》国标中测定叶酸方法为微生物法，此方法操作繁琐，检测周期长。而高效液相色谱法有着高效、快速、灵敏度高等特点，因此探索一种准确快速测定痕量叶酸的方法具有重要的意义。 本文通过大量摸索试验，采用叶酸亲和柱对食品中叶酸进行提取纯化，选用反相小粒径色谱柱 Aphasil VC-C18， 3.0× 150 mm， 2.5 um 进行分离，使用 PHRED-HR光化学衍生器对叶酸进行衍生，在荧光检测器下对叶酸进行检测有较高的出峰响应和较少的杂质干扰，最低检出限均可达0.5 ng/mL，回收率在 75%-120%之间，可以实现样品中的叶酸的准确定量。 方案思路 高效液相法测定食品中中的叶酸，采用华谱 S6000 PLUS 高效液相色谱仪搭配荧光检测器及 PHRED-HR 光化学衍生器，采用 AphasilVC-C18，3.0 × 150 mm， 2.5 um色谱柱，测定食品中的叶酸含量并验证方法可行性。 本实验检测食品种类分为果蔬类、蛋白质和淀粉较高的样品以及营养强化食品这三类，其中果蔬类采用 0.5%氨水直接提取，强化食品和蛋白质、淀粉较高的食品采用酶解法进行提取。再经过免疫亲和柱进行净化，并可实现将样品提取液浓缩。 仪器设备 图1.华谱S6000系统+华谱S6000侧面效果图 1.溶液配制 PBS 溶液： 8.0gNaCl+2.90 g Na HPO 12H20+0.24 g KH，PO+0.2 gKCl 加 990 mL纯水溶解，加纯水至1.0L。 10%抗坏血酸钠：称取 10gL-抗坏血酸钠 100 mL 容量瓶中，加水溶解混匀。 洗脱液(30%乙腈+0.2%三氟乙酸)：准确量取30mL乙腈加入到100mL容量瓶中，再加入 0.2 mL三氟乙酸，最后用纯水定容至100mL。 标准溶液配制：精密称取0.1g叶酸标准品，置于 100mL 棕色容量瓶中，加入0.5%氨水进行定容，配制成1 mg/mL 叶酸储备液，在分别用水稀释成 2.0 ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL、200.0 ng/mL 和500.0 ng/mL叶酸标准溶液，测定其线性。 2.果蔬类样品中叶酸提取 将果蔬样品进行打碎，精密称取 5.0g样品，加入0.5%氨水20mL，超声振荡 10 min，60℃水浴加热 20 min，室温进行冷却，用磷酸调节 pH 值至7.4左右，加入 PBS 溶液定容至50mL， 再进行超声10min。准确移取吸取上层液10 mL，备用。 3.谷物及强化食品中叶酸提取 婴儿配方食品、婴儿即食食品、牛奶、奶粉、谷物、能量棒等样品的操作步骤：称取1-10g样品(根据需要的检测范围确定称量多少)，置于50mL离心管中。将 25mL pH 7.4 PBS 溶液加入到离心管中，混匀。加入2g胰酶，摇床震荡10分钟。加入3mL 10%抗坏血酸钠，摇床震荡5分钟。将离心管置于37℃的水浴摇床震荡2h。然后将离心管置于100℃的水浴中静置20 min。取出离心管冷却至室温；用 pH 7.4 PBS溶液定容至50mL，摇匀。将提取液4000 r 离心10 min。准确移取吸取上层液10 mL，备用。 4.叶酸免疫亲和柱净化样品 将上述10 mL样品分批次注入免疫亲和柱，使其2-3 mL/min(1-2滴/秒)缓慢通过免疫亲和柱，直至液面下降到亲和柱管体(未完全流干)。以2-3mL/min(1-2滴/秒)流速用10.0mL水淋洗，弃去全部流出液，并使2mL-3 mL空气通过柱体。准确加入1.0mL洗脱液洗脱，流速为1 mL/min-2 mL/min(1滴/秒)，收集洗脱液于玻璃试管中，然后再加入1.0mL纯水洗脱，流速为1 mL/min-2 mL/min(1滴/秒)，收集全部洗脱液于同一玻璃试式中，混匀。上机分析。 1.色谱条件 仪器：华谱 S6000+PHRED-HR光化学衍生器(254nm)+荧光检测器 色谱柱： AlphasilVC-C18，3.0 × 150.0 mm， 2.5 um， 100A 流动相： A：50mM磷酸二氢钾溶液(pH=4.3)；B：甲醇(梯度洗脱) Time/min A/% B/% 0.0 90 10 2.6 90 10 8.5 70 30 14 70 30 15 90 10 18.0 90 10 柱温：40C 流速：0.5mL/min 进样量： 50uL 激发波长：365nm 发射波长：440nm 2.测定结果 检测叶酸20.0 ng/mL标准溶液，结果如图2所示，叶酸出峰时间为12.54 min，峰形良好且无其他干扰。 图2.20.0 ng/mL 叶酸标准溶液色谱图 按照实验步骤分别处理了苹果、白菜、黄豆、雀巢奶粉和飞鹤奶粉空白样品，得到色谱图如图3-7，由实验结果可以看出，叶酸色谱峰附近无杂质干扰，净化效果良好，测定结果见表2。 图3.苹果样品中叶酸色谱图 图4.白菜样品中叶酸色谱图 图5.黄豆样品中叶酸色谱图 图6.雀巢奶粉样品中叶酸色谱图 图7.飞鹤奶粉样品中叶酸色谱图 3.检出限和定量限 国标《GB5009.211-2014》规定：果蔬类试样称样量为5g时，检出限为 0.2 ug/100g，定量限为 0.4ug/100 g； 蛋白质、淀粉较高的试样称样量为5g时，检出限为1.0 ug/100 g，定量限为 2.0 ug/100g； 营养强化剂和强化食品称量为1g时，检出限为0.5 ug//100 g， 定量限为 1.0pg/100g.其中，奶粉等强化食品是所有检测食品中灵敏度最低的，经过前处理富集纯化，上机检出限浓度为 0.5 ng/mL，定量限浓度为1.0ng/mL。经过测定得到检出限信噪比为4.65，定量限信噪比为10.20，满足检测要求。本实验检出限和定量限与国标的对比如表1所示，检出限和定量限色谱图如图8和9所示： 表1.检出限和定量限 名称 检测限(国标)ug/100 g 定量限(国标)pg/100g 果蔬类 0.2(0.2) 0.4(0.4) 果蔬类 0.5(1.0) 1.0(2.0) 果蔬类 0.5(0.5) 1.0(1.0) 图8.检出限0.5 ng/mL叶酸色谱图 图9.定量限1.0 ng/mL叶酸色谱图 4.线性 检测1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0 ng/mL、10.0ng/mL、20ng/mL、50.0 ng/mL、200.0 ng/mL和 500.0 ng/mL叶酸标准溶液，线性相关系数R²为0.9997，结果在1.0~500.0 ng/mL的浓度范围呈良好的线性关系，标准曲线如图10所示： 5.重复性 以苹果为基质，向 5.0g苹果样品中加入1.0g/mL 标准品200ul，经过前处理以及 SPE 净化，配制成 20.0 ng/mL 加标样品，测定6针重复性，保留时间 RSD 为 0.06%，峰面积 RSD 为 0.82%，结果符合标准要求，色谱图如图11所示。 图11.叶酸重复性色谱图 6.回收率 分别以白菜、苹果和黄豆为基质进行加标回收率考察，加标量为20.0 ng/mL；以雀巢、飞鹤两种品牌奶粉为基质做加标回收，加标量为50.0 ng/mL 进行测定；每种基质平行三份。测定结果如表2所示，回收率均在75-120%之间，满足国标要求。 表2.回收率测定结果 标签含量 样品(ug/100 g) 空白样本含量 加标量 测定值 回收率 (ug/100g) (p(ug/100g) (ug/100g) /% 白菜-01 25.3 77.6 白菜-02 / 9.78 20 25.57 78.95 白菜-03 25.46 78.4 苹果-01 32.68 99.15 苹果-02 / 12.85 50 30.69 89.2 苹果-03 31.53 93.4 雀巢奶粉-01 150.38 90.1 雀巢奶粉-02/ 105.35 50 149.7 88.7 雀巢奶粉-03 151.14 91.6 飞鹤奶-01 190.38 90.76 飞鹤奶粉-02/ 145 4 192.7 95.4 飞鹤奶粉-03 189.14 88.3 黄豆-01 13.808 111.5 黄豆-02 / 9.35 20 14.14 119.8 黄豆-03 13.826 111.9 其中，测定两种品牌奶粉中叶酸实际测定含量高于标签含量，经查《GB 28050-2011食品安全国家标准预包装食品营养标签通则》要求维生素类添加含量大于等于80%标签值产品即合格，因此，产品中叶酸添加量可能高于标签值，为进一步验证采用质谱法进行奶粉中含量测定，具体测定结果见第7节。 7.质谱法测定奶粉中的叶酸含量 液相条件： 仪器： Xevo TQ高效液相色谱串联质谱 色谱柱： Alphasil VC-C18，2.1× 100 mm，2.5 um 流动相： A： 0.1%甲酸水；B：0.1%甲酸乙腈 柱温：30C 流速：0.2mL/min 进样量：2uL 洗脱梯度： Time/min A/% B/% 0 90 10 1 90 10 5 20 80 6 20 80 6.1 90 10 9 90 10 质谱条件： 离子源： ESI+； 扫描模式：MRM； 毛细管电压：2.0KV； 脱溶剂气：1000L/Hr； 脱溶剂气温度：500℃ 离子源温度：150℃ MRM 参数： 母离子 子离子 锥孔电压 碰撞能 保留时间 化合物 (m/z) (m/z) (V) (V) (min) 化合物 442 295 13 17 3.2 176.1 40 采用质谱检测奶粉中叶酸的含量，分别测得雀巢奶粉叶酸含量为103 ug/100g， 飞鹤奶粉叶酸含量为143ug/100g，与液相法测定结果基本一致。质谱图如图12所示： 图12.质谱法测定飞鹤奶粉和雀巢奶粉色谱图 结论 本研究利用 Acchrom S6000 PLUS 高效液相色谱仪，搭配 AphasilVC-C18(3.0×150 mm，2.5um)色谱柱，利用 PHRED-HR光化学衍生器对叶酸进行衍生化，在荧光检测器下对叶酸进行分析定量。前处理采用叶酸免疫亲和柱对样品进行提取净化，基线平稳，净化效果好无干扰，特异性保留目标峰，回收率在75%~120%之间。本测定方法的重复性，线性，加标回收率均满足标准要求，检出限为 0.5 ng/mL， 定量限为0.1ug/mL。该高效液相色谱法测定食品中叶酸含量具有较高的准确度和精密度，且重复性较好，能够进行推广应用。 扫一扫，关注我们 本研究利用 Acchrom S6000 PLUS 高效液相色谱仪，搭配 Aphasil VC-C18（3.0 × 150 mm, 2.5 μm）色谱柱，利用 PHRED-HR 光化学衍生器对叶酸进行衍生化，在荧光检测器下对叶酸进行分析定量。前处理采用叶酸免疫亲和柱对样品进行提取净化，基线平稳，净化效果好无干扰，特异性保留目标峰，回收率在 75%~120% 之间。本测定方法的重复性，线性，加标回收率均满足标准要求，检出限为 0.5 ng/mL，定量限为0.1µg/mL。该高效液相色谱法测定食品中叶酸含量具有较高的准确度和精密度，且重复性较好。