乳品中低聚半乳糖检测方案(液相色谱仪)

华谱科仪(北京)科技有限公司 www.acchrom-tech.com 华谱科仪(北京)科技有限公司 华谱科仪 S6000 液相色谱仪测定乳品中的低聚半乳糖 方案优势 1)方法操作简单，只需简单的衍生处理即可上机检测 2) 在液相色谱上实现乳品中低聚半乳糖的含量测定 3) 搭配荧光检测器，方法灵敏度好 4) 方法回收率好 5) 分析成本低，方法涉及的试剂均为常用化学试剂 项目背景 低聚半乳糖(Galactooligosaccharides， GOS)是一种具有天然属性的功能性低聚糖，其分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1~7个半乳糖基，即 Gal-(Gal)n-Glc/Gal(n 为0~6)。因为低聚半乳糖是一系列半乳糖基低聚糖的混合物，聚合度从2到8不等，有15种以上的组分，用外标法检测存在一定的困难，所以低聚半乳糖检测技术是低聚糖检测研究的重点，当前还没有国标方法。 目前， AOAC(Association of Official Analytical Chemists) 推荐的离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)被广泛应用于测定食品中低聚半乳糖含量。依据的理论基础是利用特定、专一的β-半乳糖苷酶水解样品中的乳糖和低聚半乳糖，产物是葡萄糖和半乳糖，再利用样品中检测出的乳糖含量计算出乳糖水解来源的半乳糖含量。最后用样品溶液中总半乳糖含量减去游离的和乳糖水解来源的半乳糖含量，然后用半乳糖差量除以聚合度计算得到样品中低聚半乳糖(GOS)的含量，食品安全国家标准《食品中低聚半乳糖的测定》(征求意见稿)也是参考 AOAC 方法建立的。但该标准方法用于低聚半乳糖的检测存在2个技术问题：1))低聚半乳糖没有统一的换算系数； 2) 该方法不适用于乳糖含量高的样品，例如乳品。 且上述 AOAC 法是使用离子交换色谱进行测定，实验仪器要求较高，所以检测方法普适性不强。而液相色谱分析法，具有分析速度快，灵敏度高，操作简单的特点，普适性广，利于推广。随着高效液相色谱技术的日趋成熟和普及，华谱尝试开发一种利用高效液相色谱法检测乳品中低聚半乳糖含量的方案。 通过检索文献和标准资料发现，目前还原糖柱前衍生常采用2-氨基苯甲酰胺衍生(2-AB)的柱前衍生方法。 低聚半乳糖为还原糖，其还原羟基端在酸性条件下被2-氨基苯甲酰胺(2-AB)荧光基团取代，使得低聚半乳糖带有苯胺衍生物荧光基团，可搭配荧光检测器进行分析。衍生反 应原理如图1所示： 图1低聚半乳糖与2-AB衍生反应原理 实验部分 样品前处理 沉淀剂Ⅰ配制：称取15.0g亚铁氰化钾，用水溶解并定容至100 mL；沉淀剂ⅡI配制：称取30.0g乙酸锌，用水溶解并定容至 100 mL。 精密称定奶粉样品2g(精确至 0.0001g) 于 50 mL离心管中，加入40℃左右温水40mL，摇匀使试样溶解，放入超声波振荡器中超声提取 20 min； 冷却到室温，加1.0mL沉淀剂I，涡旋混合，1.0 mL 沉淀剂I，涡旋混合；用氨水调节 pH约为7.2后转入100mL容量瓶中，用水定容至刻度，充分混匀，样品溶液于 4500 r/min 下离心20 min，取上清液备用。 称取 45 mg 2-氨基苯甲酰胺(2-AB)， 62.5 mg 氰基硼氢化钠(NaCNBH3)，溶解于1mL HAc-DMSO (30 ：70， v/v)中， 2-AB 和 NaCNBH3终浓度分别为 0.35M 和1.0M， 吸取低聚半乳糖原料溶液及奶粉样品前处理后上清液各 50 uL，分别加入 150pL 配制好的衍生化试剂，混匀，60℃水浴反应至少2h；衍生结束后离心取上清液用90%乙腈水溶液稀释合适倍数，过 0.22 um 微孔膜待测。 仪器配置与分析方法 色谱条件 仪器配置 Acchrom S6000 组织器 S6110 四元泵 S6210进样器 S6310 柱温箱 S6440 荧光检测器 色谱柱 AlphasilS-XIon， 4.6mm*250 mm，5 um 流动相 A：乙，B： 0.1%三氟乙酸水 流速 1.0 mL/min 进样量 10 pL 柱温 25°℃ 检测波长 激发波长：320nm， 检测波长：440 mn 结果与讨论 特征峰的选择样品： 低聚半乳糖 1.0 mg/mL(糖粉原料)； 低聚半乳糖1.28 mg/mL (糖浆原料)； 空白奶粉前处理后上清液； 以上样品均经 2-AB 衍生后离心取上清液稀释20倍(90%乙腈水稀释)进样分析；用上述方法测定低聚半乳糖及奶粉衍生物结果如图2所示。 图2空白奶粉与 GOS 原料分离色谱图(*表示特征峰) 结果表明，空白奶粉中无*峰，而GOS 糖粉或糖浆原料均含有*峰，且与前后峰分离度良好，因此选取*峰为特征峰进行单点外标定量。 空白奶粉中添加 GOS 的回收率考察 样品： 低聚半乳糖 1.0 mg/mL(糖粉原料)； 低聚半乳糖 1.28 mg/mL (糖浆原料)； 空白奶粉前处理后上清液； 空白奶粉添加 GOS 糖粉前处理后上清液 (5g GOS/100g奶粉，上清液含 GOS 1.0 mg/mL)；空白奶粉添加GOS 糖浆前处理后上清液(6.4gGOS/100g奶粉，上清液含 GOS 1.28 mg/mL)；以上样品均经2-AB衍生后离心取上清液稀释20倍(90%乙腈水稀释)进样分析； 用上述方法测定低聚半乳糖及加标奶粉衍生物结果如图3、图4与表1所示。 图3向空白奶粉中加入 GOS 糖粉分离色谱图(*表示特征峰) 图4向空白奶粉中加入 GOS 糖浆分离色谱图(*表示特征峰) 表1向空白奶粉中添加 GOS 原料的回收率 特征峰*与乳 *特征峰峰面积 回收率 糖峰分离度 (微伏*秒) 108.6% GOS 糖粉 1.0 mg/mL 3.62 909386 空白奶粉+ GOS 糖粉 1.0 mg/mL 2.75 988018 104.4% GOS 糖浆 1.28 mg/mL 3.62 1216262 空白奶粉+ GOS 糖浆 1.28 mg/mL 2.60 1269883 结果表明，向空白奶粉中分别添加 GOS 糖粉或糖浆原料，以特征峰*进行定量，回收率良好。 实际奶粉中添加 GOS 的回收率考察 样品： 低聚半乳糖1.28 mg/mL (糖浆原料)；空白奶粉前处理后上清液； 实际奶粉添加 GOS 糖浆前处理后上清液1(GOS 添加量 3.2 g GOS/100g 奶粉)； 实际奶粉添加 GOS 糖浆前处理后上清液 2(GOS 添加量6.4g GOS/100g奶粉)； 实际奶粉前处理后上清液； 以上样品均经 2-AB 衍生后离心取上清液稀释20倍(90%乙腈水稀释)进样分析； 用上述方法测定低聚半乳糖及加标奶粉衍生物结果如图5与表2所示。 分钟 图5实际奶粉添加 GOS 糖浆分离色谱图对比(*表示特征峰) 表2向实际奶粉中添加 GOS 糖浆含量计算 *特征峰峰面积 GOS 含量 GOS 添加量 GOS 添加量 /100g奶粉 理论值 /100g奶粉 计算值 回收率 (微伏*秒) /100g 奶粉 GOS糖浆 1266990 一 - - 1.28mg/mL 实际奶粉 1095138 5.53g - - - 实际奶粉添加 GOS 糖浆 1-1 1644402 8.30g 3.2g 2.77g 86.6% 实际奶粉添加 GOS 糖浆1-2 1747545 8.83g 3.2g 3.30g 103.1% 实际奶粉添加 GOS 糖浆 2-1 2275091 11.50g 6.4g 5.97g 93.3% 实际奶粉添加 GOS 糖浆2-2 2346574 11.85g 6.4g 6.32g 98.8% 结果表明，向实际奶粉中添加不同量的低聚半乳糖(糖浆原料)，选取特征峰*对低聚半乳糖进行单点外标定量，以 GOS 添加量进行计算，回收率良好，且平行样基本重复。 实际奶粉 GOS 定量 样品： 低聚半乳糖 1.20 mg/mL(糖浆原料)； 空白奶粉前处理后上清液； 以上样品均经 2-AB 衍生后离心取上清液稀释20倍(90%乙腈水稀释)进样分析； 实际奶粉1号与2号前处理后上清液； 以上样品均经 2-AB 衍生后离心取上清液稀释2倍(90%乙腈水稀释)进样分析； 用上述方法测定低聚半乳糖及实际奶粉衍生物结果如图6与表3所示。 图6实际奶粉分离色谱图(*表示特征峰) 表3实际奶粉中 GOS 含量计算 特征峰*与 *特征峰峰面积 进样稀释倍数 GOS 含量 乳糖峰分离度 (微伏*秒) /100g奶粉 GOS 糖浆 1.20 mg/mL 3.8 1170837 20 实际奶粉1号 2.2 3135574 2 1606.8 mg 实际奶粉2号 2.2 1310492 2 671.6 mg 结果表明，选取特征峰*对低聚半乳糖进行单点外标定量，实际奶粉1号中低聚半乳糖含量为 1606.8 mg GOS/100g 奶粉，实际奶粉2号中低聚半乳糖含量为671.6 mg GOS/100g奶粉。 不同稀释倍数条件下，考察灵敏度 调研市售奶粉 GOS 添加量发现，个别厂家 GOS 添加量较目前实验添加量低十个数量级左右，因此尝试向空白奶粉中添加 500 mg GOS/100g 奶粉，衍生后稀释不同倍数进样，考察回收率及检测灵敏度。 样品： 低聚半乳糖 1.28 mg/mL(糖浆原料)； 空白奶粉前处理后上清液； 以上样品均经2-AB 衍生后离心取上清液稀释20倍(90%乙腈水稀释)进样分析； 空白奶粉添加 GOS 糖浆前处理后上清液 (GOS 添加量 500 mg GOS/100g 奶粉)； 以上样品经2-AB衍生后离心取上清液分别不稀释，稀释2倍，稀释5倍(90%乙腈水稀释) 进样分析； 用上述方法测定低聚半乳糖及加标奶粉衍生物结果如图7与表4所示。 分钟 图7空白奶粉加 GOS 衍生后不同稀释倍数分离色谱图(*表示特征峰) 表4向空白奶粉中添加 GOS 糖浆含量计算 特征峰*与 *特征峰峰面积 *特征峰峰高 进样 GOS 含量 回收率 乳糖峰分离度 (微伏*秒) (微伏) 稀释倍数 /100g奶粉 GOS 糖浆 3.74 1696602 103594 20 1.28 mg/mL 空白奶粉添加 糖浆不稀释 1.90 2440898 141492 1 460mg 92.0% 空白奶粉添加 糖浆稀释2倍 2.20 1261134 79118 2 476 mg 95.2% 空白奶粉添加 糖浆稀释5倍 2.44 492514 32119 5 464 mg 92.8% 结果表明，向空白奶粉中添加 500 mg GOS/100g 奶粉，衍生后稀释不同倍数进样，对特征峰*与前面乳糖峰的分离度基本无影响，仍可以选取特征峰*对 GOS 进行定量。 不同稀释倍数下，特征峰*的峰面积与稀释倍数成比例，所以样品前处理环节，可根据样品实际情况选用较小稀释倍数，以以确保方法灵敏度。 结论 本文在现有检测还原性糖类物质方法的基础上优化低聚半乳糖的高效液相分析方法，与当前离子色谱法分析低聚半乳糖的方法相比，本文所述检测方案普适性广，利于推广。衍生方法简单快捷，检测结果稳定重复，，可搭配华谱特色亲水色谱柱与荧光检测器实现乳品中低聚半乳糖的定量检测需求。 联系我们 关注我们 华谱科仪(北京)科技有限公司 ( 热线电话：010-8410-9313 ) 邮箱： marketing@acchrom-tech.com 使用高效液相色谱法检测乳品中低聚半乳糖含量，对实际样品测定，可以实现目标峰与杂质峰的分离，加标回收率满足要求，重复性良好，操作简单。