食品中食品添加剂检测方案(液相色谱仪)

Acchrom·Tech华谱科仪华谱科仪(北京)科技有限公司 Acchrom·Tech华谱科仪(北京)科技有限公司 华谱科仪(北京)科技有限公司 华谱科仪 S6000 液相色谱仪测定食品添加剂 方案优势 1) 分离效果佳，实现5种添加剂和9种色素的良好分离 2) 色谱柱寿命高，使用预柱后，能够实现对实际样品的长时间分析 3) 适用于食品中高油脂、高蛋白、饮料、酱腌菜等样品中的测定，方法适用范围广泛 项目背景 食品添加剂是食品最常见的检测项目，其中色素、防腐剂、甜味剂更是每个食品必检项目，涉及的检测标准众多，例如《GB 5009.28-2016 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》、《GB/T 5009.140-2003饮料中乙酰磺胺酸钾的测定》、《GB 5009.121-2016食品中脱氢乙酸的测定》、《DBS13/006-2016 食品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精钠和乙酰磺胺酸钾(安赛蜜)的测定高效液相色谱法》、《GB 5009.35-2016 食品中合成着色剂的测定》《SN/T 1743-2006食品中诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的含量检测高效液相色谱法》等。由于检测样品量大，检测方法多，食品添加剂的检测耗费大量人力物力，通过上述分析发现苯甲酸、山梨酸、安赛蜜、糖精钠、脱氢乙酸的标准的色谱方法不同、但前处理方法原理相同，在理论上可以同时提取并测定；色素柠檬黄、苋菜红、胭脂红、新红、日落黄、诱惑红、酸性红、亮蓝、赤藓红前处理原理相同，在理论上也可同时提取并测定，现计划开发一种可同时提取出上述食品添加剂中的防腐剂和色素的前处理方法，并建立快速分离的液相方法，该方案不仅可节省大量人力物力，提高食品添加剂的检测效率，同时市场需求量极高。 实验部分 食品添加剂中5种添加剂和9种色素 表1中列出本方案测定的14种食品添加剂。 表1 14种食品添加剂信息表 中文名称 安赛蜜 苯甲酸 山梨酸 糖精钠 脱氢乙酸 柠檬黄 新红 英文名称 Ansai Benzoicacid Sorbic acid Saccharinsodium Dehydroaceticacid Tartrazine New red 中文名称 苋菜红 胭脂红 日落黄 诱惑红 酸性红 赤藓红 亮蓝 英文名称 Amaranth Poncea u4R S u nsetyellow FCF All urares AC Carmosine Erythroseine Brilliantblu e FCF 华谱科仪 仪器配置 华谱 S6000： Acchrom S6000 组织器， S6110 四元泵， S6210 进样器， S6310柱温箱，S6410 紫外检测器； 溶液配制 5种添加剂单标储备液(1mg/mL)：分别称取安赛蜜(98%)0.0255g、苯甲酸(99.5%)0.0251g、糖精钠(98%)0.0255g、山梨酸(99%)0.0253 g于25 mL容量瓶中，用超纯水定容；称取脱氢乙酸(99%)0.0255 g 于25 mL容量瓶中，先用 20 g/L氢氧化钠溶液溶解，然后用超纯水定容。 5种添加剂混标储备液(100 ug/mL)：分别取 2.5 mL 安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸于25 mL 容量瓶中，用超纯水定容。 9种色素单标储备液(1mg/mL)：分别称取柠檬黄(95%)0.0273g、苋菜红(85%)0.0295 g、胭脂红(85%)0.0295g、日落黄(87%)0.0286g、亮蓝(85%)0.0295g、赤藓红(95%)0.0266 g于 25 mL 容量瓶中，用超纯水定容；分别称取新红(99%)0.0104g、酸性红 0.0105 g、诱惑红(99%)0.0100g 于 25 mL 容量瓶中，用pH为6的水定容。 9种色素混标储备液：分别取 1 mg/mL 柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、赤藓红250pL，新红(1186ug/mL) 211 pL， 亮蓝500 uL，酸性红、诱惑红 125 pL 于10 mL容量瓶中，用pH为6的溶液定容，得到国标50倍定量限9种色素混标(柠檬黄、苋菜红、新红、胭脂红、日落黄、赤藓红)。 亚铁氰化钾溶液(92g/L)：称取 26.5g亚铁氰化钾，加入适量的水溶解，用水定容至250mL。 乙酸锌(183g/L)：称取1.54g乙酸锌溶于少量的水中，加入30mL冰乙酸，用水定容至1000mL。 样品制备方法 5种添加剂前处理过程： 一般样品(酱腌菜)：称取约1g(精确到0.001 g) 于50 mL离心管(加标)中，加入超纯水溶液12 mL，涡旋混匀，50℃超声20 min， 加亚铁氰化钾溶液1mL，乙酸锌溶液1mL混匀，于9500 r/min离心5 min， 水相转移至25mL容量瓶中，残渣加水10mL，涡旋 5 min 于 9500 r/min 离心5 min， 将上清液转移至同一25 mL容量瓶中，并用水定容 至刻度，混匀，过0.45 um滤膜，待HPLC上机分析。 高油脂样品(面包)：称取约1g(精确到0.001g)于50mL离心管(加标)中，加5 mL 正己烷，于60℃水浴加热超声约5 min， 并轻摇以溶解脂肪，然后加入氨水(1+99)溶液12.5 mL， 乙醇0.5 mL， 涡旋超声20 min， 加亚铁氰化钾溶液1mL，乙酸锌溶液1mL混匀，于9500 r/min 离心 5 min，弃去有机相，水相转移至25 mL容量瓶中，残渣加水5mL，涡旋5 min 于 9500 r/min 离心5 min， 将水相转移至同一25 mL 容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀，过 0.45 um滤膜，待 HPLC上机分析。 注：上述前处理方法适用于5种添加剂的分析。 9种色素前处理过程： 饮料样品(碳酸饮料)：取4mL碳酸饮料(加标)加热超声 20 min 后，定容至5mL，过 0.45 umPTFE 滤膜， 待 HPLC 上机分析。 固体样品(火腿肠双汇)：取样品1g加8mL 80℃热水(加标)振荡提取 10 min，9500 r/min 离心5 min，收集上清液，剩余固体样品加入2mL的1%氨水乙醇溶液，震荡提取 10 min， 离心 5 min 合并两次上清液，柠檬酸调节 pH至6(过膜上样)后，待 OASIS WAX小柱 (3cc， 150 mg， 部件号 186002409)净化。 净化：先将 OASIS WAX小柱分别用6mL甲醇活化， 6mL 超纯水进行平衡，取2mL待净化样品溶液过柱，弃去滤液。再分别用6mL甲醇和6mL 超纯水溶液清洗 OASIS WAX小柱。最后用2 mL 5%氨化甲醇溶液洗脱 SPE 小柱，收集洗脱液，在50℃水浴下，氮气吹干后，用2 mL 5%甲醇水溶液复溶，过 0.45 um PTFE 滤膜， 待 HPLC 上机分析。 5种添加剂 色谱条件 色谱柱：：预柱： Alphasil VC-C18， 4.6*15 mm， 5 um 分析柱： Alphasil VC-C18， 4.6*150 mm， 5 um 流动相：A：甲醇； B： 20mM乙酸铵 流速：：1mL/min 温度：40℃ 检测波长：230nm(紫外检测器) 进样体积： 10pL 结果与讨论 标准品 采用上述方法对标准品进行分析，结果如图1所示。利用华谱 S6000液相色谱系统能够实现在12分钟内对5种添加剂的基线分离。表2给出5种添加剂出峰顺序。 图15种添加剂分析结果色谱图 表2255种添加剂出峰顺序 序号 名称 1 安赛蜜 2 苯甲酸 3 山梨酸 4 糖精钠 5 脱氢乙酸 采用上述方法对实际样品中的添加剂进行测定，包括一般样品(酱腌菜)、高油脂样品(面包)，测定结果如图2-3所示。实际样品中的添加剂均实现了基线分离。 实际样品的测定 一般样品(酱腌菜)： 分钟 图2 酱腌菜分析结果色谱图 图3 面包分析结果色谱图 重复性 以5种添加剂混标为例考察方法重复性，连续进6针，见图4。各添加剂保留时间及峰面积RSD 结果见表3，结果表明该方法在连续进样时保留时间和响应重复性良好。 图4 重复性测试结果色谱图 (n=6) 表3 重复性测试保留时间及峰面积结果分析表 名称 进样序号 1# 2# 3# 4# 5# 6# RSD% 安赛 保留时间 min 4.86 4.84 4.85 4.86 4.86 4.86 0.17 蜜 峰面积 162622 162804 163039 163078 162670 162637 0.13 苯甲 保留时间 min 6.27 6.26 6.26 6.27 6.27 6.27 0.08 酸 峰面积 176222 176910 177051 177183 176444 176447 0.22 山梨 保留时间 min 9.04 9.02 9.03 9.03 9.04 9.04 0.09 酸 峰面积 226576 226664 226478 226453 226119 225975 0.12 糖精 保留时间 min 10.34 10.31 10.33 10.34 10.35 10.34 0.13 钠 峰面积 118327 118535 118474 118580 118362 118415 0.08 脱氢 保留时间 min 11.37 11.37 11.37 11.37 11.37 11.36 0.04 乙酸 峰面积 277894 279109 279357 279380 277687 278457 0.26 9种色素 色谱条件 色谱柱：预柱： AlphasilVC-C18， 4.6*15 mm， 5 um分析柱： Alphasil VC-C18， 4.6*150 mm， 5 um 流动相： A： 20mM乙酸铵；B：乙腈 流速：1mL/min 温度：35℃ 检测波长：254nm(紫外检测器) 进样体积：10uL 结果与讨论 标准品 采用上述方法对标准品进行分析，结果如图5所示。利用华谱 S6000 液相色谱系统能够实现在18分钟内对9种色素的基线分离。表4给出9种色素出峰顺序。 图59种色素分析结果色谱图 表49种色素出峰顺序 序号 名称 序号 名称 1 柠檬黄 6 诱惑红 2 新红 7 酸性红 3 苋菜红 8 亮蓝 4 胭脂红 9 赤藓红 5 落黄 采用上述方法对实际样品中的添加剂进行测定，包括液体样品(碳酸饮料)、固体样品(肠)，测定结果如图6-7所示。实际样品中的色素均实现了基线分离。 实际样品的测定 液体样品(碳酸饮料)： 图6碳酸饮料分析结果色谱图 图7肠分析结果色谱图 重复性 以9种色素混标为例考察方法重复性，连续进6针，见图8。各添加剂保留时间及峰面积RSD 结果表表5，结果表明该方法在连续进样时保留时间和响应重复性良好。 图8重复性测试结果色谱图(n=6) 表5 重复性测试保留时间及峰面积结果分析表 名称 进样序号 1# 2# 3# 4# 5# 6# RSD 柠檬 保留时间 3.64 3.63 3.67 3.64 3.64 3.63 0.40 黄 峰面积 119090 119069 119465 119201 119271 119455 0.14 新红 保留时间 5.29 5.23 5.3223 5.2913 5.29 5.27 0.58 峰面积 84234 84556 83853 84329 84357 83705 0.39 苋菜 保留时间 7.35 7.34 7.36 7.35 7.34 7.33 0.15 红 峰面积 108243 108112 108672 108489 108364 108461 0.19 胭脂 保留时间 9.86 9.87 9.86 9.86 9.87 9.86 0.06 红 峰面积 114109 114081 114336 114343 114453 114235 0.13 日落 保留时间 10.59 10.60 10.59 10.59 10.60 10.59 0.05 黄 峰面积 98981 98804 98794 98575 98838 98937 0.14 诱惑 保留时间 11.66 11.67 11.67 11.67 11.67 11.66 0.04 红 峰面积 41182 41135 41225 41140 41255 41209 0.12 酸性 保留时间 13.89 13.90 13.90 13.90 13.90 13.89 0.04 红 峰面积 25424 25416 25263 25261 25186 25443 0.43 亮蓝 保留时间 14.88 14.89 14.88 14.88 14.89 14.88 0.03 峰面积 45801 45885 45769 45776 45918 45901 0.15 赤藓 保留时间 16.32 16.32 16.31 16.32 16.32 16.31 0.03 红 峰面积 78514 78437 78509 78514 78527 78829 0.18 14种食品添加剂 色谱条件 色谱柱： Tnature C18， 4.6 mm*150 mm， 5 um 流动相： A： 20mM乙酸铵；B：甲醇 流速：1mL/min 温度：35℃ 检测波长：230、254nm(紫外检测器) 进样体积：110uL 采用上述方法对标准品进行分析，结果如图9所示。利用华谱 S6000 液相色谱系统能够实现在25分钟内对14种食品添加剂的基线分离。表6给出14种食品添加剂出峰顺序。 分钟 图9 14种食品添加剂分析结果色谱图 表614种食品添加剂出峰顺序 序号 名称 序号 名称 1 安赛蜜 8 苋菜红 2 苯甲酸 9 胭脂红 3 山梨酸 10 日落黄 4 脱氢乙酸 11 诱惑红 5 糖精钠 12 亮蓝 6 柠檬黄 13 酸性红 7 新红 14 赤藓红 结论 本文在现有国标处理方法的基础上开发了食品添加剂中的5种添加剂的高效液相色谱方法和9种色素的高效液相色谱方法，即可实现一般样品、高油脂样品中的5种添加剂和碳酸饮料以及固体样品肠中9种色素的含量测定，该方法对一般样品、高油脂样品中的添加剂液体样品碳酸饮料、固体样品肠中9种色素具有良好的分离效果，经验证该方法分析结果与国标方法测试结果几乎接近，分析结果可靠。本文在现有国标处理方法的基础上也开发了食品添加剂中5种添加剂和9种色素的高效液相色谱方法，能实实对14种物质的快速分离。 方法中采用的华谱 S6000 仪器系统稳定，精确控制流量、温度等，是保证数据可靠的前提，具有结果重复性良好等特点。另外实验中采用 Alphasil VC-C18预柱和色谱柱，可提高 柱寿命。因此，该方法非常适合食品中复杂基质的分析。 www.acchrom-tech.com 华谱科仪(北京)科技有限公司 热线电话：010-8410-9313 分离效果佳，实现5种添加剂和9种色素的良好分离，适用于食品中高油脂、高蛋白、饮料、酱腌菜等样品中的测定，方法适用范围广泛