肉类中兽残前处理检测方案

8.1 提取 称取试料2g（准确到±0.02g），于50 mL离心管中，加氘代氯霉素内标溶液100 μL，涡动混匀，静置15 min。加乙酸乙酯-氨水溶液10 mL，涡动1 min，3000 r/min离心5 min，取上清液于100 mL鸡心瓶中，残渣重复提取两次，合并3次提取液。鸡心瓶中加5%乙酸2 mL，振摇混匀，于40 ℃水浴中浓缩至1.5 mL。转至另50 mL离心管中，用5% 乙酸2 mL洗涤鸡心瓶，洗涤液转至同一离心管，加正己烷5 mL脱脂，涡动1 min，3000 r/min离心5 min弃上层，下层提取液重复脱脂一次，备用。 关键词：碱性条件下提取，提取3次 要点： 氟苯尼考及氟苯尼考胺，在碱性条件下，更加容易被有机溶剂提取，可以获得满意的提取回收率。 碱化的乙酸乙酯提取3次，浓缩后正己烷除脂。   关键词：5%乙酸 要点： 在蒸发前，在鸡心瓶中加5%乙酸。有助于保护氟苯尼考胺在操作过程（合并、浓缩）中的回收率。 8.2 净化 MCX 固相萃取柱依次用甲醇2 mL和水2 mL活化。备用液过柱，用5 %乙酸2 mL淋洗， 用10 %氨甲醇5 mL洗脱。收集洗脱液，于40 ℃氮气吹干。用30 %乙腈水溶液500 μL溶解残余物，滤膜过滤，供超高效液相色谱-串联质谱测定。 关键词：GB 31658.5-2021与GB/T 22959净化步骤区别 要点： GB/T 22959之前的氟苯尼考检测标准，净化采取的是液液萃取法。 对于样品基质比较复杂的情况，干扰物质较多，单纯的液液萃取和脱脂净化，不够理想的时候，使用SPE小柱将有更好净化效果，因此新标准GB 31658.5采取了MCX固相萃取净化。   关键词: 5 mL氨甲醇洗脱，氮吹 要点： Tips：色谱柱或保护柱前加溶剂效应消除器（PN：AN80C037，谱宁科技），对于氟苯尼考和氟苯尼考胺检测限和定量限比较高的药物，5 mL氨甲醇洗脱后，可不经过氮吹，过滤膜后直接进行分析，不但可以满足检测要求，而且可以提高效率和目标物回收率，同时可以避免出现溶剂效应问题。（标准中氮吹的过程，一方面是为了浓缩样品，另一方面是为了转换溶剂，减少分析中出现的溶剂效应问题）。 注：溶剂效应消除器相关文章 发明专利：LC、LC/MS必备！改善峰形、提高柱效和分离度神器！ 关键词：MCX固相萃取柱的特点和使用注意事项 要点： 标准中使用的MCX 60 mg/3 mL (PN:AN60A012，纳鸥科技），混合型强阳离子交换反相柱，提供了双重保留模式：强阳离子交换+反相。 MCX小柱对于碱性化合物具有高的选择性，能够选择性保留阳离子化合物或者碱性化合物。 当目标化合物酸化后，呈现出阳离子特征，通过电荷和分子间力的结合，从而保留在MCX小柱上，随后可以通过改变离子强度、PH值破坏分子间作用力，把目标分析物洗脱下来。 所以前面提到的备用液是5%的乙酸，就是为了净化步骤上柱创造一个酸性条件。 氟苯尼考和氟苯尼考胺在酸性环境下表现为阳离子，上柱后就能保留在MCX小柱上。随后是用5%的乙酸淋洗，去除干扰物的同时，需要的分析物仍旧保留在小柱上。 洗脱时，洗脱液是10 %氨甲醇，这时目标分析物就不在表现为阳离子，从而洗脱下来，实现了净化效果。 GB 31658.2-2021前处理关键点和要点 动物性食品中氯霉素残留量的测定 液相色谱－串联质谱法   原理 试料中残留的氯霉素，采用间位氯霉素或氘代氯霉素作内标，依次用乙腈、4%氯化钠去蛋白，正己烷脱脂，乙酸乙酯提取，固相萃取柱净化，氮气吹干，液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。 8.1 提取 取试料5 g（准确至±0.02 g），加内标工作液250 µL、乙腈5 mL、 4 %氯化钠溶液5 mL，涡旋振荡2 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液，残渣重复提取1 次，合并上清液。加正己烷5 mL，涡旋振荡1 min，2 000 r/min离心10 min，弃去上层液，正己烷重复处理1次。加水饱和的乙酸乙酯溶液5 mL，涡旋振荡1 min，2 000 r/min离心10 min，上层液转移到15 mL离心管中，重复提取1次，合并提取液，氮气吹干，加水-乙腈（95:5）3 mL使溶解，备用。 关键词：动物组织中蛋白质、脂肪、杂质的去除 要点： GB 31658.2是采用4%的氯化钠溶液对样品中的蛋白质进行沉淀，同时也加入了乙腈进一步沉淀样品组织中的蛋白质。然后，用正己烷进行萃取，去除动物组织中脂肪和杂质。接下来乙酸乙酯反萃取。   关键词：氮气吹干 要点： 提取后，注意氮气要吹干，如果没有吹干，样品中含有乙酸乙酯对后面的进行小柱净化有影响，从而影响回收率。   关键词：加水饱和乙酸乙酯溶液反萃取 要点： 由于洗脱液是用甲醇和水（1：1）4 mL，体积比较大，含水也比较高，不易挥发和浓缩。 加水饱和乙酸乙酯溶液进行反萃，实际上是进行了一个溶剂转换。 转换的目的，一方面是乙酸乙酯溶液比较容易吹干，另一方面也增加了一次萃取和净化，使得样品更加干净，进一步去除杂质。 8.2 净化 取固相萃取柱，依次用甲醇、水各10 mL预洗。备用液过柱，加水洗柱2次，每次3 mL， 加流动相4 mL，以1 mL/min速度洗脱，收集洗脱液。加水饱和乙酸乙酯溶液4 mL，涡旋振 荡1 min，2000 r/min离心5分钟，取上层液，重复处理1次，合并上层溶液，氮气吹干。加流动相1.0 mL使溶解，滤过，供液相色谱-串联质谱测定。 关键词：预洗 要点： 在净化过程中，C18小柱需要依次用甲醇、水各10 mL预洗，标准中净化柱使用的是传统的C18小柱 200 mg/6 mL (PN：AN60B004，纳鸥科技），是一个很早就商品化的小柱，净化之前，C18小柱需要提前预洗，不能直接对干的小柱进行活化，不然会影响到回收率。 这个与后续商品化的HLB-P小柱不同，HLB-P小柱省去传统的活化、平衡步骤，样品经提取后直接过柱。   关键词：多步骤的萃取和反萃取 要点： 氯霉素提取和净化过程中经过了多步骤的萃取和反萃取。 具体步骤：乙腈+4 %氯化钠溶液提取→正己烷脱脂→加水饱和乙酸乙酯反萃→水-乙腈（95:5）复溶解→流动相洗脱→水饱和乙酸乙酯→流动相溶解→上机。 在GB 31658.2这是一个很经典的提取体系，这么多次的萃取，实际上是利用了氯霉素在不同的溶剂体系中溶解度差异，从而来完成样液的净化和溶剂转换。整个过程包括了，萃取、反萃取、固相萃取柱净化，是一个很典型的样品净化和富集案例。 经过以上复杂的前处理操作流程，操作手法不太熟练，以及某些关键点没有注意到，很容易导致回收率受到影响。 GB 31656.11-2021前处理关键点和要点 水产品中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量的测定   第一法 高效液相色谱（替代GB/T 22961-2008）   原理 试样中土霉素、四环素、金霉素和多西环素的残留经柠檬酸缓冲溶液提取，固相萃取柱净化，液相色谱荧光检测器测定，外标法定量。 8.1 提取 取试料5 g（准确至±0.02 g），加柠檬酸缓冲液20 mL，涡旋震荡2min，超声10 min， 6000 r/min离心10 min，取上清液，残渣加柠檬酸缓冲液10 mL，重复提取两次，合并三次上清液，待净化。 关键词：GB 31656.11-2021与GB/T 22961-2008在提取过程中的区别 要点： 与GB/T 22961-2008相比，GB 31656.11-2021的提取次数为3次，同时去掉了正己烷脱脂的步骤。 8.2 净化 固相萃取柱依次用甲醇10 mL、水10 mL、柠檬酸缓冲液5 mL活化，取备用液过柱，用甲醇溶液10 mL、水10 mL淋洗，抽干，加甲醇10 mL，洗脱，收集洗脱液，40℃氮气吹干， 残渣加磷酸二氢钾溶液1.0 mL使溶解，超声1min，0.22 μm水相滤膜滤过，供高效液相色谱测定。 关键词：GB 31656.11-2021与GB/T 22961-2008在净化过程中的区别 要点： 在净化步骤方面，GB 31656.11-2021的SPE净化的步骤更简单了，GB/T 22961-2008是需要用两种不同类型的SPE柱，先后进行净化，新的标准去掉了阳离子交换净化步骤。只保留了HLB的净化。 另外，在HLB的洗脱液也有差异，在GB/T 22961是用乙酸乙酯做洗脱液，新国标的洗脱液直接用甲醇。 第二法 液相色谱-串联质谱法   原理 试样中土霉素、四环素、金霉素和多西环素的残留用 Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液提取，醋酸铅沉淀，正己烷除脂，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。 18.1提取取试料2 g（准确至±0.02 g），加Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液6 mL、醋酸铅溶液2 mL， 涡旋混合1 min，超声10 min，4℃以8000 r/min离心5 min，取上清液。残渣分别用Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液5 mL，重复提取两次，合并3次提取液。   关键词：醋酸铅 要点： 提取过程增加了醋酸铅沉淀，正己烷脱脂。醋酸铅是一种常用的蛋白沉淀试剂，可以更有效去除动物组织提取液中的蛋白。同样，与方法一一样，提取3次。 18.2净化 向上述提取液加正己烷10 mL，涡旋1 min，8000 r/min离心5min，取下层溶液，加Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液至20.0 mL，备用（鳗鲡、蟹和海参样品，需按照上述方法净化两次）取固相萃取柱依次用甲醇、水各5 mL活化，取备用液10.0 mL过柱，控制流速约1 mL/min， 用水、甲醇溶液各5 mL淋洗萃取柱，弃去流出液，减压抽干5 min。加甲醇-乙酸乙酯5 mL洗脱，收集洗脱液，40 ℃氮气吹至近干，加甲酸溶液（0.1%）-乙腈1.0 mL溶解残渣，涡旋混匀, 滤过，为防药物变性，需及时供液相色谱-质谱仪测定。   关键词：过柱速度慢 要点： GB 31656.11四环素类测定，加入醋酸铅后，仍然会出现过柱困难。主要是样品提取过程中把蛋白等杂质去除不太干净，需要充分地离心；建议离心时间稍微长一点，低温高速多次离心，快速过滤。    关键词：GB 31656.11-2021方法二和方法一净化过程的区别 要点： 方法二选择的HLB小柱是小规格60mg/3 mL (PN：AN60A002，纳鸥科技），方法一是500mg规格。 另外，方法二在上柱之前加入了正己烷脱脂，由于使用的是小规格的小柱，需要尽可能去除干扰物，还有，方法二洗脱液是甲醇-乙酸乙酯，混合溶液来做洗脱液。最后，甲酸-乙腈复溶解，实现溶剂转换 2022年5月19日，纳鸥科技公众号发布了文章《为什么别人做的36项兽残回收率总比我高？（上篇）》：对GB 31656.8-2021、GB 31658.17、GB 31656.13三个常用标准的样品前处理关键点和要点等进行了总结，收到了广大检测工作者的积极反响。现将后续3个标准：GB 31658.5（氟苯尼考及氟苯尼考胺残留量）、GB 31658.2（氯霉素残留量）、GB 31656.11（土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量）的前处理关键点和要点整理出来，供各位老师参考。GB 31658.5-2021前处理关键点和要点动物性食品中氟苯尼考及氟苯尼考胺残留量的测定8.1 提取 取试料5 g（准确至±0.02g），加内标工作液250 µL、乙腈5 mL、 4 %氯化钠溶液5 mL，涡旋振荡2 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液，残渣重复提取1 次，合并上清液。加正己烷5 mL，涡旋振荡1 min，2 000 r/min离心10 min，弃去上层液，正己烷重复处理1次。加水饱和的乙酸乙酯溶液5 mL，涡旋振荡1 min，2 000 r/min离心10 min，上层液转移到15 mL离心管中，重复提取1次，合并提取液，氮气吹干，加水-乙腈（95:5）3 mL使溶解，备用。关键词：新国标与之前的国标GB/T20756-2006和GB/T22338-2008的区别要点：Ø   GB/T20756-2006是在碱性条件下用乙酸乙酯提取，后续是不用SPE进行净化。Ø   GB/T22338-2008这个方法比较复杂，针对不同的动物组织采用了不同的提取剂，然后后续用到SPE的净化，比如说鸡肉和内脏的组织是用硅胶小柱净化，相对比较复杂一些。Ø   GB 31658.2-2021是采用4%的氯化钠溶液和乙腈做提取剂。因为GB/T20756-2006是一个多残留方法，包括氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素，需要同时兼顾这三种药物残留的提取，碱性条件的提取，主要是为了让氟苯尼考、甲砜霉素有更加好的提取回收率。而GB 31658.2-2021是一个单残留的测定，只需考虑氯霉素残留的提取，所有无需碱性条件的提取。关键词：动物组织中蛋白质、脂肪、杂质的去除要点：Ø   GB 31658.2是采用4%的氯化钠溶液对样品中的蛋白质进行沉淀，同时也加入了乙腈进一步沉淀样品组织中的蛋白质。然后，用正己烷进行萃取，去除动物组织中脂肪和杂质。接下来乙酸乙酯反萃取。关键词：氮气吹干要点：Ø   提取后，注意氮气要吹干，如果没有吹干，样品中含有乙酸乙酯对后面的进行小柱净化有影响。关键词：加水饱和乙酸乙酯溶液反萃取要点：Ø   由于洗脱液是用甲醇和水（1：1）4 mL，体积比较大，含水也比较高，不易挥发和浓缩。Ø   加水饱和乙酸乙酯溶液进行反萃，实际上是进行了一个溶剂转换，Ø   转换的目的，一方面是乙酸乙酯溶液比较容易吹干，另一方面也增加了一次萃取和净化，使得样品更加干净，进一步去除杂质。8.2 净化 取固相萃取柱，依次用甲醇、水各10 mL预洗。备用液过柱，加水洗柱2次，每次3 mL， 加流动相4 mL，以1 mL/min速度洗脱，收集洗脱液。加水饱和乙酸乙酯溶液4 mL，涡旋振 荡1 min，2000 r/min离心5分钟，取上层液，重复处理1次，合并上层溶液，氮气吹干。加流动相1.0 mL使溶解，滤过，供液相色谱-串联质谱测定。关键词：预洗要点：Ø   在净化过程中，C18小柱需要依次用甲醇、水各10 mL预洗，标准中净化柱使用的是传统的C18小柱 200 mg/6 mL (PN：AN60B004），是一个很早就商品化的小柱，净化之前，C18小柱需要提前预洗，不能直接对干的小柱进行活化，不然会影响到回收率。Ø   这个与后续商品化的HLB-P小柱不同，HLB-P小柱省去传统的活化、平衡步骤，样品经提取后直接过柱。关键词：多步骤的萃取和反萃取要点：Ø   氯霉素提取和净化过程中经过了多步骤的萃取和反萃取，Ø   具体步骤：乙腈+4 %氯化钠溶液提取→正己烷脱脂→加水饱和乙酸乙酯反萃→水-乙腈（95:5）复溶解→流动相洗脱→水饱和乙酸乙酯→流动相溶解→上机。Ø   在GB 31658.2这是一个很经典的提取体系，这么多次的萃取，实际上是利用了氯霉素在不同的溶剂体系中溶解度差异，从而来完成样液的净化和溶剂转换。整个过程包括了，萃取、反萃取、固相萃取柱净化，是一个很典型的样品净化和富集案例。Ø   经过以上复杂的前处理操作流程，操作手法不太熟练，以及某些关键点没有注意到，很容易导致回收率受到影响。GB 31658.5-2021动物性食品中氟苯尼考及氟苯尼考胺残留量的测定液相色谱－串联质谱法原理试料中残留的氟苯尼考与氟苯尼考胺，用碱化的乙酸乙酯提取，正己烷除脂，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。8.1提取 称取试料2g（准确到±0.02g），于50 mL离心管中，加氘代氯霉素内标溶液100 μL，涡动混匀，静置15 min。加乙酸乙酯-氨水溶液10 mL，涡动1 min，3000 r/min离心5 min，取上清液于100 mL鸡心瓶中，残渣重复提取两次，合并3次提取液。鸡心瓶中加5%乙酸2 mL，振摇混匀，于40 ℃水浴中浓缩至1.5 mL。转至另50 mL离心管中，用5% 乙酸2 mL洗涤鸡心瓶，洗涤液转至同一离心管，加正己烷5 mL脱脂，涡动1 min，3000 r/min离心5 min弃上层，下层提取液重复脱脂一次，备用。关键词：碱性条件下提取，提取3次要点：Ø   氟苯尼考及氟苯尼考胺，在碱性条件下，更加容易被有机溶剂提取，可以获得满意的提取回收率。Ø   碱化的乙酸乙酯提取3次，浓缩后正己烷除脂。关键词：5%乙酸要点：Ø   在蒸发前，在鸡心瓶中加5%乙酸。有助于保护氟苯尼考胺在操作过程（合并、浓缩）中的回收率。8.2 净化 MCX 固相萃取柱依次用甲醇2 mL和水2 mL活化。备用液过柱，用5 %乙酸2 mL淋洗， 用10 %氨甲醇5 mL洗脱。收集洗脱液，于40 ℃氮气吹干。用30 %乙腈水溶液500 μL溶解残余物，滤膜过滤，供超高效液相色谱-串联质谱测定。关键词：GB   31658.5-2021与GB/T 22959净化步骤区别要点：Ø   GB/T 22959之前的氟苯尼考检测标准，净化采取的是液液萃取法。Ø   对于样品基质比较复杂的情况，干扰物质较多，单纯的液液萃取和脱脂净化，不够理想的时候，使用SPE小柱将有更好净化效果，因此新标准GB 31658.5采取了MCX固相萃取净化。关键词: 5 mL氨甲醇洗脱，氮吹要点：Tips：色谱柱或保护柱前加溶剂效应消除器（PN：AN80C037），对于氟苯尼考和氟苯尼考胺检测限和定量限比较高的药物，5 mL氨甲醇洗脱后，可不经过氮吹，过滤膜后直接进行分析，不但可以满足检测要求，而且可以提高效率和目标物回收率，同时可以避免出现溶剂效应问题。（标准中氮吹的过程，一方面是为了浓缩样品，另一方面是为了转换溶剂，减少分析中出现的溶剂效应问题）。关键词：MCX固相萃取柱的原理和使用注意事项要点：Ø   标准中使用的MCX 60   mg/3 mL (PN:AN60A012)，混合型强阳离子交换反相柱，提供了双重保留模式：强阳离子交换+反相。Ø   MCX小柱对于碱性化合物具有高的选择性，能够选择性保留阳离子化合物或者碱性化合物。Ø   当目标化合物酸化后，呈现出阳离子特征，通过电荷和分子间力的结合，从而保留在MCX小柱上，随后可以通过改变离子强度、PH值破坏分子间作用力，把目标分析物洗脱下来。Ø   所以前面提到的备用液是5%的乙酸，就是为了净化步骤上柱创造一个酸性条件。Ø   氟苯尼考和氟苯尼考胺在酸性环境下表现为阳离子，上柱后就能保留在MCX小柱上。随后是用5%的乙酸淋洗，去除干扰物的同时，需要的分析物仍旧保留在小柱上。Ø   洗脱时，洗脱液是10 %氨甲醇，这时目标分析物就不在表现为阳离子，从而洗脱下来，实现了净化效果。GB 31656.11-2021水产品中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量的测定 一法高效液相色谱（替代GB/T 22961-2008）原理试样中土霉素、四环素、金霉素和多西环素的残留经柠檬酸缓冲溶液提取，固相萃取柱净化，液相色谱荧光检测器测定，外标法定量。8.1 提取 取试料5 g（准确至±0.02 g），加柠檬酸缓冲液20 mL，涡旋震荡2min，超声10 min， 6000 r/min离心10 min，取上清液，残渣加柠檬酸缓冲液10 mL，重复提取两次，合并三次上清液，待净化。关键词：GB 31656.11-2021与GB/T 22961-2008在提取过程中的区别要点：与GB/T 22961-2008相比，GB 31656.11-2021的提取次数为3次，同时去掉了正己烷脱脂的步骤。8.2 净化 固相萃取柱依次用甲醇10 mL、水10 mL、柠檬酸缓冲液5 mL活化，取备用液过柱，用甲醇溶液10 mL、水10 mL淋洗，抽干，加甲醇10 mL，洗脱，收集洗脱液，40℃氮气吹干， 残渣加磷酸二氢钾溶液1.0 mL使溶解，超声1min，0.22 μm水相滤膜滤过，供高效液相色谱测定。关键词：GB 31656.11-2021与GB/T 22961-2008在净化过程中的区别要点：在净化步骤方面，GB 31656.11-2021的SPE净化的步骤更简单了，GB/T 22961-2008是需要用两种不同类型的SPE柱，先后进行净化，新的标准去掉了阳离子交换净化步骤。只保留了HLB的净化。另外，在HLB的洗脱液也有差异，在GB/T 22961是用乙酸乙酯做洗脱液，新国标的洗脱液直接用甲醇。 二法液相色谱-串联质谱法原理试样中土霉素、四环素、金霉素和多西环素的残留用Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取，醋酸铅沉淀，正己烷除脂，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。18.1提取 取试料2 g（准确至±0.02 g），加Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液6 mL、醋酸铅溶液2 mL， 涡旋混合1 min，超声10 min，4℃以8000 r/min离心5 min，取上清液。残渣分别用Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液5 mL，重复提取两次，合并3次提取液。关键词：醋酸铅要点：提取过程增加了醋酸铅沉淀，正己烷脱脂。醋酸铅是一种常用的蛋白沉淀试剂，可以更有效去除动物组织提取液中的蛋白。同样，与方法一一样，提取3次。18.2净化 向上述提取液加正己烷10 mL，涡旋1 min，8000 r/min离心5min，取下层溶液，加Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液至20.0 mL，备用（鳗鲡、蟹和海参样品，需按照上述方法净化两次）取固相萃取柱依次用甲醇、水各5 mL活化，取备用液10.0 mL过柱，控制流速约1 mL/min， 用水、甲醇溶液各5 mL淋洗萃取柱，弃去流出液，减压抽干5 min。加甲醇-乙酸乙酯5 mL洗脱，收集洗脱液，40 ℃氮气吹至近干，加甲酸溶液（0.1%）-乙腈1.0 mL溶解残渣，涡旋混匀, 滤过，为防药物变性，需及时供液相色谱-质谱仪测定。关键词：过柱速度慢要点：GB 31656.11四环素类测定，加入醋酸铅后，仍然会出现过柱困难。主要是样品提取过程中把蛋白等杂质去除不太干净，需要充分地离心；建议离心时间稍微长一点，低温高速多次离心，快速过滤。关键词：GB 31656.11-2021方法二和方法一净化过程的区别要点：方法二选择的HLB小柱是小规格60mg/3 mL (PN：AN60A002，纳鸥科技），方法一是500mg规格。另外，方法二在上柱之前加入了正己烷脱脂，由于使用的是小规格的小柱，需要尽可能去除干扰物，还有，方法二洗脱液是甲醇-乙酸乙酯，混合溶液来做洗脱液。最后，甲酸-乙腈复溶解，实现溶剂转换。