食品中17种氨基酸含量检测方案(氨基酸分析仪)

SSL-CA22-164Excellence in Science Excellence in ScienceLC-296 使用氨基酸分析仪测定食品中17种氨基酸的含量 LC-296 摘要：本文使用岛津氨基酸分析仪 LC-16AAA 建立了17种氨基酸茚三酮柱后衍生高效液相色谱分析方法。参考 GB 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》进行实验，实验结果表明：17种氨基酸在 10~500 nmol/L 线性浓度范围内，相关系数均大于 0.9999，准确度为87.0~113.1%。精密度实验中， 10nmol/L的17种氨基酸标准溶液保留时间 RSD%为0.01~0.30%，峰面积RSD%为 0.39~3.57%。该方法茚三酮柱后衍生和样品测定为全自动完成，线性良好，分离效果良好，可为食品中氨基酸的测定提供参考。 关键词：LC-16AAA 氨基酸分析仪钠型 茚三酮柱后衍生食品中氨基酸 氨基酸为两性电解质，在酸性条件下，能被树脂表面的活性基团(-SO*)吸附，使用氨基酸分析仪时，通常利用Na+型或Li*型磺酸基强酸性阳离子交换树脂。通过不同 pH 系列的洗脱液使氨基酸逐步洗脱下来，洗脱顺序依次为酸性氨基酸、羟基氨基酸和中性氨基酸、芳香族氨基酸和碱性氨基酸等。Na*型树脂一般用于蛋白质水解液中的氨基酸分析， Li*型树脂一般用于生理体液中的氨基酸分析。 目前，国内外氨基酸分析方法主要分为直接分析法和衍生化间接分析法。其中，衍生化方式又分为柱前、 实验部分 1.1仪器配置 LC-16AAA 氨基酸分析仪，配置信息如下： 系统控制器： CBM-20A自动进样器： SIL-16输液泵： LC-16×3脱气机： DGU-20A5R阀切换单元：FCV-11AL鼓泡单元： DGU-10B化学反应箱： CRB-40柱温箱：CTO-16L检测器：SPD-16色谱工作站：LabSolutions Ver. 5.106 柱上和柱后衍生化。柱后衍生阳离子交换色谱法是目前食品氨基酸分析最为常用的分析方法。该方法衍生反应速度非常快，衍生物极其稳定，衍生试剂能同时与一级和二级氨基酸快速反应并被检测，故可以快速测定氨基酸的总量。 本实验使用岛津氨基酸分析仪 LC-16AAA 钠型分析柱参考国标 GB 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》，建立了17种氨基酸茚三酮柱后衍生高效液相色谱分析方法。 1.2分析条件 分析柱： Shimadzu Shim-pack Amino-Naa(100mm×6.0 mml.D.， 5um)(岛津(上海)实验器材有限公司， P/N： 228-18837-91) 捕氨柱： Shimadzu Shim-pack ISC-30/S0504 Na (50 mm×4.0mml.D.， 5 um) (岛津(上海)实验器材有限公司， P/N： 228-14206-91)流动相：钠型氨基酸流动相试剂包流动相A，B，C (岛津(上海)实验器材有限公司， P/N：228-21195-94) 衍生试剂：茚三酮溶液(岛津(上海)实验器材有限公司， P/N： 208-09626) 流 动 相 流 速 ： 0 . 6 m L / m i n 反应液流速：0.2 mL/min 衍生温度：130℃柱温：60℃进样量：20uL检测波长：570nm/440 nm 洗脱方式：梯度洗脱，A相起起浓度为100%，时间程序如表1所示。 表1 梯度洗脱时间程序 时间(min) 单元 处理命令 值 9.00 泵 B Conc 0 13.00 泵 B Conc ( 17.20 泵 B Conc 8 17.21 泵 B Conc 11 20.80 泵 B Conc 11 20.81 泵 B Conc 50 22.00 泵 B Conc 58 22.01 泵 B Conc 100 28.80 泵 SV(PumpA) B-A-A 29.30 泵 B Conc 100 29.31 泵 B Conc 0 33.00 泵 SV(Pump A) A-A-A 35.00 泵 T.Flow 36.50 泵 T.Flow 43.30 泵 T.Flow 0.7 44.00 泵 T.Flow 0.6 45.00 控制器 Stop 1.3标准品 17种氨基酸混合标准品：2.5 umol/mL(岛津(上海)实验器材有限公司， P/N：208-09625)，用流动相A逐级稀释为10、20、50、100、200和500 nmol/mL 的标准溶液。 1.4样品前处理 1.4.1市售纯牛奶 称量1.001g摇匀后的牛奶液体于20mL玻璃瓶中，加入15 mL 6mol/L盐酸溶液，振荡混匀(备注：牛奶盒标签告知每100 mL含蛋白质2.0g， 称量时使试样中蛋白质含量在10~20 mg范围内)。用氮吹仪将玻璃瓶充入氮气，置换出瓶内空气，在充氮气状态下拧紧瓶盖。放入111℃的电热鼓风恒温箱内，水解22h后，取出，冷却至室温。打开玻璃瓶盖，将溶液过滤入50mL容量瓶中，多次用纯水冲洗玻璃瓶，移入同一一量瓶中，用纯水定容至刻度，振荡混匀。 移取1mL滤液到5mL玻璃小瓶中，用氮吹浓缩仪在50~60℃加热环境下干燥，干燥后残留物用1mL纯水溶解，再蒸干。用1mL pH 2.2柠檬酸钠缓冲溶液(或者流动相A液)加入小瓶内溶解，振荡混匀后，吸取溶液通过0.22 um 水系过滤器后，转移至仪器进样瓶中，供测定用。 1.4.2市售橙子 市售橙子去去后用破壁机打碎，搅拌均匀，称量1.195 g 橙子于20 mL玻璃瓶中，其他操作同市售纯牛奶。 结果与讨论 2.1化合物信息 目标化合物信息见表 2。 表2 17种氨基酸信息表 序号 中文名称 英文缩写 CAS. 号 1 L-天冬氨酸 Asp 56-84-8 2 L-苏氨酸 Thr 72-19-5 3 L-丝氨酸 Ser 56-45-1 4 L-谷氨酸 Glu 56-86-0 5 L-脯氨酸 Pro 147-85-3 6 甘氨酸 Gly 56-40-6 L-丙氨酸 Ala 56-41-7 8 L-胱氨酸 56-89-3 9 L-缬氨酸 72-18-4 10 L-蛋氨酸 Met 63-68-3 11 L-异亮氨酸 lle 73-32-5 12 L-亮氨酸 Leu 61-90-5 13 L-酪氨酸 Tyr 60-18-4 14 L-苯丙氨酸 Phe 63-91-2 15 L-组氨酸 His 71-00-1 16 L-赖氨酸 L-ys 56-87-1 17 L-精氨酸 Arg 74-79-3 2.2方法学信息 按1.2中的分析条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，采用外标法建立线性校准曲线，脯氨酸的检测波长是440 nm， 其余16种氨基酸的检测波长是570 nm， 结果如图1和图2所示，17种氨基酸在10~500 nmol/L 浓度范围内，线性相关性良好，相关系数均大于0.9999，准确度为87.0~113.1%。选择浓度为 10 nmol/L的17种氨基酸标准溶液连续进样测定6次，保留时间 RSD%为 0.01~0.30%；峰面积RSD% 为0.39~3.57%，结果见表3所示。实验结果表明，该分析方法具有良好的精密度。仪器检测限参照信号噪音关系的方法，以10 nmol/L 的17种氨基酸标准溶液，检测限系数为3.0，运用公式检测限=3×10×N/S (N：噪音，S：峰高)i计算得出。 图1 17种氨基酸标准溶液图谱(100 nmol/mL) 相关系数 面积 [*107] 0.0 4.0 5.06.0 浓度[*10~2] 化合物名 相关系数 8.0 图2 17种氨基酸校准曲线 表3 17种氨基酸方法学信息 序号 英文缩写 校准曲线 相关系数 检测限 (nmol/mL) 准确度 (%) 保留时间 RSD(%) 峰面积 RSD(%) Asp Y=(17856.9)X+(12357.0) ≥0.9999 0.33 89.1~104.8 0.30 1.52 2 Thr Y=(20055.3)X+(4639.39) > 0.9999 0.30 88.8~105.6 0.17 0.88 3 Ser Y=(19276.5)X+ (5924.58) >0.9999 0.30 90.2~105.1 0.13 1.25 4 Glu Y=(19907.1)X+(-6856.35) > 0.9999 0.41 95.5~107.0 0.15 2.97 5 Pro Y=(4922.06)X+(-2062.63) > 0.9999 4.58 97.2~105.9 0.24 3.57 6 Y=(25236.4)X+(-13881.4) > 0.9999 0.33 92.4~102.7 0.07 1.60 7 Y=(16789.5)X+(-15645.5) ≥0.9999 0.54 93.2~105.2 0.09 2.25 8 Y=(23893.6)X+(-76969.0) > 0.9999 0.53 97.9~113.1 0.15 1.80 9 Y=(17597.1)X+(29756.1) > 0.9999 0.22 88.5~105.3 0.06 2.13 10 Met Y=(22816.5)X+(9541.50) >0.9999 0.22 90.0~104.9 0.05 0.39 11 1le Y=(18367.1)X+(-8449.54) > 0.9999 0.37 91.9~105.6 0.05 2.10 12 Leu Y=(22701.8)X+(18322.3) ≥0.9999 0.25 87.0~104.8 0.04 0.99 13 Tyr Y=(22400.3)X+(19886.7) > 0.9999 0.39 93.9~106.9 0.04 1.52 14 Phe Y=(21927.0)X+(8804.20) >0.9999 0.26 92.5~107.8 0.02 2.22 15 Y=(19382.0)X+(-4028.70) > 0.9999 0.15 95.4~107.6 0.01 0.61 16 Y=(15677.1)X+(-22720.5) > 0.9999 0.27 99.0~109.0 0.01 0.63 17 Y=(9673.87)X+(-12668.2) > 0.9999 0.75 98.1~110.7 0.01 1.38 2.3实际样品分析 将市售牛奶和橙子按1.4样品前处理后，用1.2方法进样分析，色谱图如图3和图4所示，所测样品中各氨基酸的含量如表4所示。 图3 牛奶样品色谱图 图4橙子样品色谱图 表4牛奶和橙子中氨基酸含量检测结果 序号 英文缩写 牛奶样品含量 橙子样品含量 (g/100g) (g/100g) Asp 0.215 0.096 2 Thr 0.077 0.012 3 Ser 0.102 0.021 4 Glu 0.386 0.048 5 Pro 0.112 0.078 0.076 0.015 0.089 0.022 8 0.005 N.D. 9 0.092 0.018 10 Met 0.015 0.003 11 lle 0.088 0.011 12 Leu 0.152 0.020 13 Tyr 0.068 0.008 14 Phe 0.099 0.012 15 His 0.052 0.009 16 Lys 0.128 0.023 17 Arg 0.129 0.077 结论 本文使用岛津氨基酸分析仪 LC-16AAA钠型分析柱建立了17种氨基酸茚三酮柱后衍生高效液相色谱分析方法。结果表明，17种氨基酸在10~500 nmol/L线性浓度范围内，相关系数均大于0.9999，准确度为87.0~113.1%。精密度实验中，10nmol/L的17种氨基酸标准溶液保留时间 RSD% 为 0.01~0.30%，峰面积RSD% 为 0.39~3.57%。参考国标 GB 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》对市售牛奶和橙子进行测试，得到了测试结果。该方法茚三酮柱后衍生和样品测测为全自动完成，线性良好，分离效果良好，可为食品中氨基酸的测定提供参考。 岛津应用云 zaVWIHS 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterTel： mail： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn 本文使用岛津氨基酸分析仪LC-16AAA钠型分析柱建立了17种氨基酸茚三酮柱后衍生高效液相色谱分析方法。结果表明，17种氨基酸在10~500 nmol/L线性浓度范围内，相关系数均大于0.9999，准确度为87.0~113.1%。精密度实验中，10 nmol/L的17种氨基酸标准溶液保留时间RSD%为0.01~0.30%，峰面积RSD%为0.39~3.57%。参考国标GB 5009.124-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》对市售牛奶和橙子进行测试，得到了测试结果。该方法茚三酮柱后衍生和样品测定为全自动完成，线性良好，分离效果良好，可为食品中氨基酸的测定提供参考。