细胞中培养及滴度测定检测方案(大分子作用仪)

SARTORIUS 图1 应用指南 关键词或短语： Ambr15、细胞培养、Octet 抗体、生物层干涉技术、BLI、细胞系开发、滴度、DOE、克隆选择、培养基优化、 糖基化、多变量数据分析、CQA 高效细胞株开发：结合Ambr@-15细胞培养与Octet@滴度测定加速工艺优化 引言 细胞系的开发涉及到对数以千计的克隆进行筛选，以找到稳定、能产生高产量的生物产品并表现出所需的关键质量属性(CQA)的克隆。通常情况下，将在小规模的生物反应器培养中进行筛选和工艺优化活动，以确保结果能转化为较大的生物反应器规模。性能数据主要基于细胞生长、细胞活率、代谢产物分析和产品滴度，并在整个培养过程期间进行评估。通常情况下，产品滴度数据会有一个较长的周转时间，在这个时间里，将样品提交给分析小组进行分析。将分析技术引入细胞培养过程的开发工作流程可大大加快得到结果的时间。 Octet@平台是一种分析仪器，可以很容易地在细胞系开发实验室中实施，便于快速测定产品收率。这样可以在工艺结束时直接做出决定，例如哪些样品需要送去进行质量分析，从而减少总体样品数量。还可以根据所有的性能数据设计下一次实验，而不是等待几天或几周拿到到产品收率结果后才可进行下一次实验设计。这里我们展示了 Ambr@15细胞培养系统的强大功能，该系统集成了 Vi-CELLXR和 Ambr@分析模块以及 Octet@平台，在培养基筛选和工艺优化实验中确定最佳收率条件。 Ambr@15 高通量全自动细胞培养 Ambr@ 15细胞培养是一个自动化、高通量的一次性生物反应器系统，可同时对多达48个一次性微型反应器进行并行操作，并可由一名操作者进行管理。 在相同大小、多并行的生物反应器中比较培养物，使科学家在细胞系开发工作流程的早期，就能在代表性的生物反应器模式中筛选更多的克隆，并在更短的时间内获得有意义的结果。可以建立多个实验以评价不同的细胞系或克隆，并研究工艺参数的影响，例如温度、补料、培养基成分、通气量和接种密度。这些参数结合在一起，使细胞系选择、培养基选择和工艺优化能够快速有效地执行。 Ambr@15 细胞培养是全球实验室普遍应用的行业标准微型生物反应器系统。Ambr 15中的研究表明，与摇瓶或孔板培养相比，由于高水平的自动化及可靠独立的 pH和溶氧工艺的控制，结果大大改善。灵活的操作允许培养物以batch、Fed-batch，甚至是模拟灌流模式运行。由于工作容积小(10-15mL)，小规模的搅拌式生物反应器罐体，通过节省大量的培养基和补料降低了每项实验的成本。 为了了于产品定量和 CQA 评估， Ambr 15和 Octet 生物层干涉技术可作为平台技术，以管理细胞系开发工作流程(图1)。 Octet@非标记分子互作分析系统 Octet@系统采用非标记、无流路的生物层干涉(BLI)技术，采用浸入即读的检测方式，利用微量板和涂有蛋白配体的专有生物传感器，使配体和相关的结合分子之间产生特定结合。这些系统通常用于受体与抗体、病毒颗粒、重组蛋白和许多其他生物分子结合的动力学和亲和力常数分析。对于 IgG滴度测定，可将涂有蛋白A或蛋白 G 的Octet@生物传感器浸入 IgG样品中，生物传感器和 IgG 之间会通过Fc 区域发生结合。 BLI可测定生物传感器末端表面的光干涉图谱的变化，其中光的波长来自两层反射：生物传感器末端表面的生物分子层和内部玻璃层。反射光的光谱曲线随着分子层的光学厚度而变化。检测器通过检测这种光谱曲线的位移，并在传感图上显示为波长的变化(nm偏移)。 (Octet@分析的关键功能是，样品的折射率变化不影响干涉光谱的位移。这减少了一定的基质效应，使 Octet能够对纯化的样品和异质的粗样品裂解液中的IgG浓度进行量化。这一优势使得分析时间大大缩短，因为样品可简单地转移到微量板中，蛋白A或G生物传感器浸入样品，只需一个步骤快速完成分析。此外，新推出的用于唾液酸和甘露糖筛选的 Sartorius GlyS 和 GlyM试剂盒， 与滴度测量生物传感器一起使用，以更好地了解随着不同培养基或加工条件变化的产品质量变化。 Octet@平台的关键优势包括： ( ■通过使用粗样品和即用型蛋白A或蛋白G生物传感器大大缩短了分析时间；在Octet @ RH96上可在5分钟内获得多达96个样品滴度。 ) ·节省成本，可在Octet@上完成更多的项目，所需的分析时间最短(表1将Octet@与其他常用于滴度测定的平台进行了比较) Octet@平台、HPLC和手动 ELISA 在 mAb 滴度方面的比较。在这个示例中，一个高通量筛选项目，总共10，000个mAb 的滴度测定。表中的数据假定 Octet@ ELISA 和 HPLC的分析劳动时间分别为0.2小时、0.5小时和3小时。 表1 Octet ELISA HPLC FTE人工费 15X 3X 得出结果的时间(小时) 52 625 1040 项目数/年 40 3 2 克隆和培养基筛选的 Octet和Ambr 15细胞培养设置 样品转移 SARTORIUS SARTORIUS Ambr 15 Ambr@15 Octet@ 选择 Octet@非标记生物分子相互作用分析 ·滴度测定 ·评价关键质量属性(CQA) ▪质量和稳定性监测 采用 MODDE@软件进行数据收集和分析 ·吸收来自平台的数据，提供更好的决策 ·帮助团队选择更好的克隆，筛选更多的培养基并更快地优化工艺 Ambr15中的培养基筛选实验 带有底部通气的 Ambr@15细胞培养的标准微型生物反应器(图2)接种密度为3E5个细胞/mL、起始体积为 13mL。每个微型生物反应器都有单独的气体通路进入培养液。 pH和 DO 的控制环路通过按需施加 CO和O，以及在整个过程中设定为 0.15 mL/min 的固定压体气体(空气)来维持目标设定点。设定点如下； pH7.0(上限为7.1)， DO 40%，温度36.8℃，搅拌速度 1300 rpm。 作为本实验的一部分，用两个不同的克隆研究了五种不同的培养基。 Ambr15中的工艺优化实验 带有底部通气的 Ambr@15细胞培养的示准微型生物反应器，接种密度为 3E5个细胞/mL、三种不同起始体积介于12至14mL范围内。每个微型生物反应器都有单独的气体通过通气管进入培养液。 pH和 DO 的控制环路通过按需施加 CO，和·2，以及固定压载气体(空气)来维持目标设定点。在此实验中，压载气体(空气)的流速介于 0.05mL/min至0.25mL/min 之间。工艺的设定点如下： pH7.0(上限为7.1)，DO 40%，温度36.8℃。 作为 DOE 实验的一部分，研究了四种不同的搅拌速度，介于1050至1650 rpm 的范围内。 培养基和补料 专有的基础培养基和补料培养基可用于实验。两项实验中，自动将每天的补料和消泡液加入每个罐体中。 采样与分析 通过联用的 Vi-CELLXR (Beckman Coulter，美国)获得了活细胞密度(VCC)计数。通过集成 Ambr@分析模块获得 pH测定值。根据制造商的方案，用 EKF BIOSEN S-Line器械(EKF-Diagnostic GmbH，德国)离线进行了葡萄糖和乳酸的测定。每天都测定细胞活率和细胞计数，滴度测定的截止点设定为活率70%，即当活率低于70%时，不测定滴度。为了测定滴度，通过 Ambr@15细胞培养每天自动取样。这些样品在6600g下离心5分钟，保留无细胞上清液用于滴度测定。 Octet@中的滴度测定 在所需的96孔板中稀释无细胞上清液样品。然后，在非剧烈震荡下，将96孔板涡旋至少1分钟。OctetQKe 与蛋白A生物传感器一起使用。该系统适用于浓度介于1pg/mL和500 ug/mL 之间的蛋白的测定，对于较高的蛋白滴度，样品稀释在培养基中。浓度已知的标准品用于标准曲线生成(图3)。将生物传感器浸入再生缓冲液中，然后再浸入中和缓冲液中，每次浸入5秒钟，重复三个循环，即可再生用于重复使用传感器。定量测定时间设定为120秒，样品板温度设定为 30℃。 图3 IgG滴度。(A)由五个培养基生长条件中的两次重复产生的 lgG 分子与蛋白 a 生物传感器结合曲线。 (B)校准品曲线(蓝色， 0-500 (ug/mL))上绘制的所有96个样品IgG浓度(橙色) 培养基筛选实验 将 Octet@平台与 Ambr@ 15细胞培养联合使用，可使细胞系开发者在开发的早期阶段确定最佳途径，以便选择最佳克隆和最佳培养基组合。本研究通过对两个不同的克隆进行五种不同的培养基组合评估，证明了使用 Ambr@ 15细胞培养在一项实验中进行多种条件的便利、简单和速度。 克隆1(图4-克隆1)表明，五个培养基中活细胞计数和细胞活率基本一致，培养基3和培养基5中的最高细胞密度略高。产品滴度结果(图4B)清楚地强调了培养基5是生产mAb表现最好的培养基，这在细胞特定生产率(Qp)图(图4D)中显示。 克隆2的结果(图5-克隆2)显示，在五种培养基中，细胞生长情况相当，直到第6天以后，培养基1和培养基2中的活细胞密度峰值和细胞活率都超过了其他培养基。对于这个克隆，培养基3、4和5中的细胞活率从第8天起就开始下降。在滴度图(图5B)中，我们可以看到在培养基1和培养基2中都有较高的产品产量，但总体而言，培养基2在第8天后具有较高的生产力，导致较高的Qp(细胞特定生产率)数值(图5D)。0 此外，两个克隆的比较表明，总体上克隆2达到的最大产品滴度是克隆1最佳结果的两倍以上。然而，如果选择培养基5作为最佳培养基，那么结果表明克隆2具有较低的性能，因为培养基5与该克隆组合时的生产率较低。因此，不应低估一起筛选多个克隆和不同培养基类型的影响，因为性能会有很大的不同。 工艺优化实验 实验设计(DOE) 是一种合理的、具有成本效益的实际实验方法，可提供大量关于一个或多个因素对响应变量影响的信息。 DOE 还可识别重要的相互作用，这些相互作用在一次仅用一个因素进行实验时可能会被忽略。 Ambr@ 15 软件包括一个 MODDE@ DOE 的许可证，该许可证已集成，允许进行 DOE 实验， 并在Ambr@15系统的设置中产生影响。包含在 DOE 研究中的工艺参数可在 Ambr@15中进行标记；这有利于实验的运行，并在完成后可在MODDE@中轻松转移并分析结果。集成在 Ambr@15软件中的 DOE MODDE@软件使科学家们能够快速建立一个设计空间，同时改变相关生物工艺条件。在整个过程中使用Octet@检测产品滴度，可立即进行数据分析和进一步的实验计划，并对项目安排产生积极影响。 在本实验中，搅拌速度、压载气流速度和起始体积是一项实验中可变的所有因素。我们采用了一个简化的组合设计，有限的实验和重复次数，在所研究的因素之间取得了良好的平衡。细胞计数和产品滴度结果用于计算 Qp。 表2 DOE 研究的工艺参数和响应概述 工艺参数 范围 搅拌速度 1050-1650 rpm 通气量(空气) 0.05-0.25 mL/ min 起始体积 12-14mL 响应 Qp(细胞特异性生产率) DOE 软件 MODDE@ 为实验设计以及统计数据分析和可视化提供了一个易用、友好的界面。与设计向导和分析向导一起， MODDE@通过工艺研究为用户提供了指导。 响应轮廓图(图6)显示了搅拌速度和通气组合如何影响Qp。在低速搅拌时，增加通气(空气)的流速有一个微小的但积极的影响，I，当搅拌速度增加到1200rpm时，气体的流速似乎没有影响。然而，在最高的搅拌速度下，其实际上对 Qp有不利的影响，较低的气体流速是可取的。总的来说，在较高的搅拌速度和较低的气体流速下，可看到最高的细胞特定生产率。 一般来说，随着搅拌速度的增加， kLa-传质系数也会增加；这是生物反应器将氧气转移到培养物中的能力的测量。这是由于搅拌器的能量输入为气泡提供了更好的分布并缩减了气泡的规格。与较大的气泡相比，较小的气泡可改善氧气的转移情况，因为其在单位液体体积内有较大的气液界面，而且其在培养基中的停留时间较长。再加上增加注入培养物的气体量，这将进一步提高 kLa， 然而施加在细胞上的更高的剪切力可能会影响细胞活率，这反过来将会降低细胞特定生产率。 主效应图是一个单一工艺变量的各个水平下的平均响应值的图。搅拌速度主效应图(图7A)仅显示了搅拌速度和细胞生产力 Qp之间的关系。随着搅拌速度提高到约1500rpm， 之后细胞生产力趋于平稳，在测试的最高搅拌速度下， Qp有非常轻微的下降。细胞活率曲线(数据未显示)显示，在较高的通气和较高的搅拌条件下，细胞活率随着时间的推移下降稍快。虽然在较高的搅拌速度下获得了最大的Qp，但对于这个特定的克隆，似乎观察到一些剪切灵敏度。 本研究中起始体积的主效应图(图7B)表明，较低的培养体积提供了较高的Qp(每个细胞的收率较高)。改变生物反应器内部的体体会改变气体交换的总表面积。在 Ambr@15细胞培养中，顶空体积和液体体积之间的界面面积对整个罐体 kLa 的贡献比大型生物反应器要大。此外，在较低的工作体积中，在相同的搅拌速度下，单位体积的功率输入上升，这意味着直接用于破坏和促进气泡在液体中悬浮的能量输入更大，这也将对 kLa 做出重要贡献。因此，在工艺优化过程中，必须仔细考虑培养体积与其他参数的关系。 DOE 实验提供了对产品收率如何受不同工艺参数影响的深刻见解， 可以单独(主效应图)、组合(轮廓图)或以其他形式查看，这可能有助于确定哪些变量对特定细胞系和/或工艺至关重要，这些知识可用于支持进一步的优化工作。这项研究的结果表明，对于所测试的克隆，较高的搅拌速度、较低的通气和较低的起始体积可获得最高的细胞特定生产 率，但在定义最佳目标设定点时一定要充分考虑其他重要的因素，例如细胞活率。 嵌入 Ambr@15 MODDE@的强大功能允许进行高通量的DOE 研究，，同时使用 Octet@进行产品滴度分析，其结果有助于理解工艺参数与特定克隆的细胞生产力之间的关系。 图7 (A)搅拌速度和(B)起始体积的细胞特定生产率(Qp)的主效应图在MODDE软件中进行分析 1600 1650 B --- Bdd@@ VCifof MPPLS 1.00000000 缩写词表 总结 BL 生物层干涉技术 CQA 关键质量属性 DO 溶解氧 DOE 实验设计 在细胞系开发工作流程中，将Octet@平台与 Ambr@15细胞培养系统联合使用，可以方便、快速地进行产品定量，与新推出的 Sartorius Octet@ GlyS 和 GlyM 试剂盒相结合，还可评估关键质量属性。 ELISA 酶联免疫吸附测定 HPLC高效液相色谱法 lgG 免疫球蛋白 G Qp 细胞特定生产率(pg蛋白质/细胞/天) 用于哺乳动物细胞培养的 Ambr@ 15 细胞培养自动化微型生物反应器系统，每次实验可运行48×15 mL的培养物，从而为并行筛选多个细胞系或克隆提供了相当大的优势，并降低了与培养基和补料相关的实验成本，尤其是对于分批补料或强化生物反应器工艺。另一方面， Octet@可对粗样品进行工艺分析，仅需极少的样品处理步骤。与传统的滴度测定技术(如ELISA或 HPLC)相比， Octet@能以极少的分析人员参与，实现更快的产量分析周转。 在这些研究中，通过比较相同大小、多并行生物反应器中的培养物，以根据产品滴度和细胞特定生产率，快速确定培养基和克隆的最佳组合，我们已经证明了 Ambr15细胞培养与Octet@平台组合的力量。然后，用 DOE 实验研究了不同的物理工艺参数：起始体积、搅拌和压载气体对产品产量的作用。 ( 参考文献 ) ( 1 . Biolayer Interferometry as an Alternative to HPLC forMeasuring Product Concentration in Fermentation Broth， Anurag S. et al.， LCGC， Volume 35， Issue 12，870-877. ) 销售与服务联系方式 更多联系信息，请访问 www.sartorius.com.cn 赛多利斯(上海)贸易有限公司 邮箱lab.cn@sartorius.com 服务热线 400 920 9889| 800 820 9889 上海 上海市浦东新区盛荣路388 弄百佳通产业园3号楼， 7-11 层，200120 电话+86 216066 6100 北京 北京市顺义区空港工业区B 区裕安路 33号， 101300 电话+86 10 8042 6300 广州 广州市越秀区水荫路 117号 1105单元， 510075 电话+86 20 37617284 ( 技木规格如有变更，恕不另行通知。 ) ( 赛多利斯保留最终解释权和修改权。 ) ( 版本04|2022 ) 了解更多： www.sartorius.com/cld 前景介绍生物创新药的开发是一个复杂的过程，而构建一个适合于生产的高表达稳定细胞株是第一步，也是关键的一步。挑选到理想的高表达克隆后，就要开始选择商业化培养基或者定制培养基进行细胞培养优化。高通量、标准化、自动化的细胞培养和工艺优化能帮助我们在获得更准确结果的同时加速细胞株开发进度。Ambr® 15 高通量全自动细胞培养Ambr®15细胞培养系统是全球实验室普遍应用的行业标准微型生物反应器系统。作为一个自动化、高通量的一次性生物反应器系统，其能够以10-15mL的体积模拟大规模生物反应器所提供的功能和工艺控制。该系统兼具并行处理能力和卓越的重现性，可快速实现包括实验设计(DOE)研究在内的高通量工艺优化，可有效缩短时间、减少试剂使用量并节省人工成本。Octet® 非标记分子互作分析系统Octet®系统采用非标记、无流路的生物层干涉（BLI）技术，采用浸入即读的检测方式，是列入美国药典的分子相互作用检测标准。基于生物层干涉技术原理，通过监测生物传感器表面的生物分子结合所带来的膜层厚度变化来检测分子间相互作用的动力学变化或者浓度数据。该系统在生命科学领域应用非常广泛。这些领域包括受体与抗体、病毒颗粒、重组蛋白和许多其他生物分子结合的动力学和亲和力常数分析。本应用中，介绍了如何使用Ambr® 15高通量全自动细胞培养系统和Octet®非标记分子互作分析系统联合进行培养基筛选和工艺优化，加速细胞株开发工作流程，以超快速度筛选出高产量高质量的单克隆细胞株（图1）。实验设计 实验1  培养基筛选使用两个不同的克隆研究了五种不同的培养基Ambr® 15细胞培养系统生物反应器温度：36.8℃接种细胞密度：3E5cells/mL培养体积：13mLPH：7.0(上限为7.1)DO：40%压载气体流速：0.15mL/min搅拌速度：1300rpm每天添加消泡剂和补料（见图2）图2Octet®中的产量(滴度)测定仪器机型：Octet® R8传感器类型：ProteinA/ ProteinG定量时间：120s样品板温度: 30℃在本实验中，2个克隆在5种不同培养基中使用XR进行细胞计数，同时使用Octet®进行滴度测定。结果与讨论本应用通过对两个不同的克隆进行五种不同的培养基组合评估，证明了联合使用Ambr® 15和Octet®在一项实验中进行多种条件的便利、简单和速度。克隆1的结果（图3）表明，五个培养基中活细胞计数和细胞活率基本一致，培养基3和培养基5中的最高细胞密度略高。产品滴度结果（图3B）表明，培养基5是生产mAb表现最好的培养基。这与细胞特定生产率（Qp）（图3D）结果完全一致。图3. 克隆1在不同培养基中的细胞计数和滴度分析。使用XR进行细胞计数，同时使用Octet®进行高通量滴度测定。克隆2的结果（图4）显示，在五种培养基中，细胞生长情况相当，直到第6天以后，培养基1和培养基2中的活细胞密度峰值和细胞活率都超过了其他培养基。对于这个克隆，培养基3、4和5中的细胞活率从第8天起就开始下降。培养基1和培养基2中都有较高的产品滴度，但总体而言，培养基2在第8天后具有较高的生产力，导致较高的Qp（细胞特定生产率）数值（图4D）。图4. 克隆2在不同培养基中的细胞计数和滴度分析。使用XR进行细胞计数，同时使用Octet®进行高通量滴度测定。两个克隆的比较表明，克隆2达到的最大产品滴度是克隆1最大滴度的两倍以上。然而，如果选择培养基5作为最佳培养基，那么结果表明克隆2具有较低的性能，因为培养基5与该克隆组合时的生产率较低。因此，不应低估一起筛选多个克隆和不同培养基类型的影响，因为产品性能会有很大的不同。 实验2  工艺优化MODD®软件设置DOEAmbr® 15细胞培养系统生物反应器温度：36.8℃接种细胞密度：3E5cells/mL培养体积：12~14 mLPH：7.0(上限为7.1)DO：40%压载气体流速：0.05~0.25mL/min搅拌速度：1050~1650rpm每天添加消泡剂和补料Octet®中的产量(滴度)测定仪器机型：Octet® RH96传感器类型：ProteinA/ ProteinG定量时间：120s样品板温度:30℃在本实验中，搅拌速度、压载气体流速和起始体积是一项实验中可变的所有因素。我们通过MODD®软件设置DOE。DOE研究的工艺参数和响应概述结果与讨论本研究利用Ambr® 15中的DOE MODDE®软件快速建立一个实验设计，改变相关生物工艺条件。在整个过程中使用Octet® 检测产量(滴度)，可立即进行数据分析和进一步的实验计划，并对项目安排产生积极影响。响应轮廓图（图5）显示了搅拌速度和通气速率组合如何影响Qp。在低速搅拌时，增加通气（空气）的流速有一个微小的但积极的影响，当搅拌速度增加到1200 rpm时，气体的流速似乎没有影响。然而，在最高的搅拌速度下，其实际上对Qp有不利的影响，较低的气体流速是可取的。总的来说，在较高的搅拌速度和较低的气体流速下，可看到最高的细胞特定生产率。图5. 搅拌与通气对终点处Qp影响的响应轮廓图。在MODDE®软件中进行分析。主效应图是一个单一工艺变量的各个水平下的平均响应值的图。本研究中搅拌速度的主效应图（图6A）表明随着搅拌速度提高到约1500rpm，之后细胞特异性生产率趋于平稳。虽然在较高的搅拌速度下获得了最大的Qp，但对于这个特定的克隆，较高的搅拌速度产生了较强的剪切力，细胞活率也会下降很快。起始体积的主效应图（图6B）显示，较低的培养体积提供了较高的Qp（每个细胞的收率较高）。在Ambr®15细胞培养系统中，顶空体积和液体体积之间的界面面积对整个罐体kLa的贡献比大型生物反应器要大。此外，较低的工作容积，在相同的搅拌速度下，单位体积的功率输入上升，这意味着直接用于破坏和促进气泡在液体中悬浮的能量输入更大，这也将对kLa做出重要贡献。因此，在工艺优化过程中，必须仔细考虑培养体积与其他参数的关系。图6. （A）搅拌速度和（B）起始体积的细胞特定生产率（Qp）的主效应图。在MODDE®软件中进行分析。 总结  Ambr® 15高通量全自动细胞培养系统集成了XR和Ambr® 分析模块，功能强大；Octet®高通量分子互作分析系统，在培养基筛选和工艺优化实验中快速确定最佳收率条件，与全新推出的Octet® GlyS和GlyM试剂盒相结合，还可评估关键质量属性。加速整个细胞株开发流程，为新药上市赋能。二者的主要优势有：- 实验流程简化，具备并行筛选多种条件的能力；- 控制性能提升，包括pH和DO在内的工艺参数；- 样品无需处理，大大缩短了分析时间，Octet® RH96上可在5分钟内获得多达96个样品检测；- 工艺优化中，证实了Octet®与Ambr®15在MODDE®软件上联合使用是评估各种参数的理想组合。 下载  下载应用指南《高效细胞株开发：结合Ambr® 15 细胞培养与Octet® 滴度测定加速工艺优化》了解更多高效细胞株开发策略点击下载 获取全文