火龙果酒中品质特性检测方案(感官智能分析)

2021年1月第 42卷第1期食品研究与开发应用技术-94 DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2021.01.016 美极梅奇酵母与酿酒酵母混合发酵对火龙果酒品质特性的影响 刘晓柱，赵湖冰，黎华，李银凤，于志海，刘晓辉，HARDIE William James12，黄名正' (1.贵州理工学院，贵州贵阳550003；2.常州大学，江苏常州213000) 摘 要：为探讨美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima， Mp)对火龙果酒品质特性的影响，Mp与酿酒酵母(Saccha-romyces cerevisiae， Sc)以共接种(Mp+Sc)方式进行混合发酵，从火龙果酒基本理化指标、电子感官特性以及香气特性方面进行综合评判。同时，分析混合发酵过程中菌株生长特性和发酵特性动态变化。结果表明，混合发酵可降低火龙果酒挥发性酸含量和酸味电子感官滋味特性，增加火龙果酒挥发性酯类、醛酮类、烃类物质种类和含量，降低挥发性酸类物质的含量。随着混合发酵的不不进行，Mp菌群所占比例逐渐降低，在发酵后期，Sc逐渐成为优势菌株。发酵过程中CO，释放率表现出先增加，然后逐渐降低的趋势；而 pH 值则相反，表现出先降低后逐渐增加的趋势。因此，Mp 主要在火龙果酒发酵前期发挥作用，与 Sc 混合发酵，影响火龙果酒的酸味特性和挥发性风味物质种类或含量。 关键词：火龙果酒；美极梅奇酵母；混合发酵；品质分析；发酵特性 Effects of Co-inoculation with Metschnikowia pulcherrima and Saccharomyces cerevisiae on the Attributes ofPitaya Wine LIU Xiao-zhu'， ZHAO Hu-bing'， LI Hua'， LI Yin-feng'，YU Zhi-hai'， LIU Xiao-hui'，HARDIE William James，HUANG Ming-zheng* (1. Guizhou Institute of Technology， Guiyang 550003， Guizhou， China； 2. Changzhou University， Changzhou213000， Jiangsu， China) Abstract： To investigate the effects of Metschnikowia pulcherrima (Mp) on the attributes of pitaya wine， mixedfermentation were conducted via co-inoculation with Mp and Saccharomy cescerevisiae (Sc)， and then traits offermented pitaya wine were assessed from the physicochemical indexes， electronic sensory and aroma profiles.In addition， the dynamic changes of Mp and Sc strains growth and fermentation characteristics were alsodetected during the mixed fermentation. The results demonstrated that mixed fermentation could reduce thevolatile acid content and the electronic taste characteristics of sour taste， increase the types and contents ofvolatile esters， aldehydes ketones and hydrocarbons， and reduce the content of volatile acids. With thecontinuous fermentation， the proportion of Mp strain gradually decreased， and at the later stage of fermentation，Sc strain gradually became the dominant species. Furthermore， the COrelease rate increased first and thendecreased gradually， and the pH decreased first and then increased gradually during the fermentation process.Therefore， it was deduced that Mp strain mainly activated in the early stage of pitaya wine fermentation， andco-inoculation with Mp and Sc influenced the sour characteristic and volatile flavor substance type or content offiery dragon fruit wine. Key words： pitaya wine； Metschnikowia pulcherrima； mixed fermentation； quality analysis analysis； fermen-tation characteristics ( 基金项目：贵州省科技计划 项 目(黔科合平台人才[2017] 5 7 89 、 黔 科合平台人才[2018]5 603 、 黔 科合支撑[2018] 2 319 ) ) ( 作者简介：刘晓柱(1 9 84一)，男(汉)，副教授，博士，研究方向：酿酒微生物资源的挖掘与应用 。 ) 引文格式： 刘晓柱，赵湖冰，黎华，等.美极梅奇酵母与酿酒酵母混合发酵对火龙果酒品质特性的影响J].食品研究与开发，2021，42(1)：94-100. LIU Xiaozhu， ZHAO Hubing， LI Hua， et al. Effects of Co-inoculation with Metschnikowia pulcherrima and Saccharomycescerevisiae on the Attributes of Pitaya Wine[J]. Food Research and Development，2021， 42(1)：94-100. 酿造酒由原料经发酵后获得的酒精饮料，原料转化为乙醇主要由酵母菌进行生物转化。根据酵母菌发酵特性将其分成酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae ，Sc)和非酿酒酵母(Non-Saccharomyces cerevisiae，NSc)两大类。Sc 主要进行酒精发酵，将原料中的糖转化为乙醇、二氧化碳和其它副产物。利用 Sc 进行纯种发酵，操作简单、易于控制，但发酵酒中风味物质种类及含量均有限，酒质风味较为单一。近年来利用 NSc与Sc 进行混合发酵改善果酒的风味，已成为研究的一个热点。NSc 可产生多种酯类、醇类、甘油以及多种酸类等风味物质，在很大程度上影响果酒的色泽、风味以及复杂度，对果酒的感官品评具有重要的影响B-5。 美极梅奇酵母 (Metschnikowia pulcherrima，Mp)是一种常见的 NSc，天然存在于各种水果、蜜腺、花朵等植物结构上图。在葡萄汁的酒精发酵前期，通常情况下可以检测到 Mp的存在。Clemente-Jimenez 等研究发现，在Mp与 Sc 共培养时，二者具有协同作用，有助于包括脂肪酸、酯和萜烯醇等多种芳香化合物的产生。研究还发现，某些Mp 菌株能够表达高水平的β-葡萄糖苷酶，并作用于多种含糖苷键的风味前体物质，有助于如萜烯类风味物质的释放，增强酒体风味特性。此外，Mp与 Sc混合发酵还能够降低发酵酒中的乙醇含量，同时增加酒体复杂度，可用于低度酒的发酵生产。但 Mp与 Sc混合发酵对火龙果酒特性的影响还未见有相关报道。 火龙果是一种广泛分布于我国南方地区的水果品种，包括红皮白肉、红皮红肉和黄皮白肉3种，富含多种营养物质!。贵州省2001年开始引种试种，作为全省农村产业革命重点发展的水果之一，截至2018年，全省火龙果总产量为4.6万吨，产值达4.1亿元。罗甸火龙果和关岭火龙果也已成为国家地理标志产品，受到国家层次的保护。由火龙果发酵生产的火龙果酒，香气独特，口感较佳，且兼具保健功能，深受消费者的喜爱。但目前火龙果酒发酵菌株通常采用葡萄酒活性干酵母，菌株品种有限，发酵酒体单一，同质化较为严重。采用非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵，可较好的解决这一问题。因此，本研究采用非酿酒酵母Mp 与 Sc 共接种，进行混合发酵，分析其对火龙果酒品质特性的影响。 1材料与方法1材料与试剂 新鲜红心火龙果：贵州省安顺市关岭县；赖氨酸固体培养基、WL营养琼脂鉴定培养基(Wallersteinlaboratory nutrient agar)：贵州博奥瑞杰生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯；Mp：中国工业微生物菌种保藏管理中心；Sc ZYMAFLORE X16(简简X16)：法国LAFFORT公司。 1.2 仪器与设备 UH5300紫外分光光度计：日本日立公司；雷磁PHSJ-3FpH仪：上海仪电科学仪器股份有限公司；SA408B电子舌味觉系统：日本 Insent 公司；TQ8040NX气相质谱联用仪(GC-MS)：日本岛津仪器有限公司。 1.3 方法 1.3.1 菌株培养 酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基 (yeast extractpeptone eextrose medium， YEPD)(酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、琼脂 20 g/L)活化-80℃保存的 Mp、Sc 菌株。挑取 Mp、Sc 单克隆分别接种于YEPD 液体培养基中，28℃，180 r/min 培养24h，备用。 1.3.2 发酵条件 取新鲜火龙果，去皮，打浆，调整糖度为 24°Brix，pH值为3.5，加入40mg/L 二氧化硫、200 mg/L果胶酶，过夜处理。分装处理后的火龙果浆至2L无菌三角瓶中，装量为 70%。将培养好的Mp、Sc 接种至火龙果浆中，使其 Mp终浓度为 10cfu/mL，Sc终冬度为10°cfu/mL。接种方式为Mp+Sc组共同接种Mp 和Sc 菌株，Sc 单独接种 Sc 菌株。接种后，插上呼吸器，密封，室温(24℃)放置12h。待发酵启动后，转移至18℃冷库中，静置发酵16d。分别在发酵的第0、2、4、8、12、16天取样，(1)称重，计算CO， 释放率；(2)测定 pH值；(3)经适当浓度梯度稀释后，分别涂布在赖氨酸培养基和上，培养48 h 计数，从而分析 Mp、Sc菌株细胞个数。发酵结束后，离心，取上清液，分别用于常规理化指标、电 96 子舌和气相质谱联用仪(gas phase mass spectrometer，GC-MS)检测。 1.3.3 测定条件 1.3.3.1 火龙果酒常规理化指标测定 参照 GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定火龙果酒中乙醇体积分数、pH值、总酸、总糖。 1.3.3.2 火龙果酒感官特性测定 取 80 mL火龙果酒样品至电子舌检测烧杯中。按照仪器说明书步骤，进行火龙果酒感官特性的检测。采样时间120s，采样速度为1次/s，每个样品平行测定3次。 1.3.3.3 火龙果酒挥发性香气特性测定 采用顶空固相微萃取 (solidphase microextraction，SPME)技术提取火龙果酒香气成分，参考李凯等方法对火龙果酒挥发性香气物质进行分析。以环己酮为内标，采用内标法进行物质的定量分析。 1.3.4 数据整理与统计分析 采用 Microsoft Excel 2010整理试验数据，并以平均值+标准差形式表示。采用 SPSS 21.0软件进行数据显著性分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。 2结果与分析 2.1 火龙果特性 酿造原料红心火龙果采摘于2018年9月贵州省安顺市关岭县，颜色粉红色，糖度为(9.1±0.01)°Brix，pH 值为 3.41±0.01(图1)。 图1本研究所用红心火龙果 Fig.1 Red pitaya used in this study 2.2 菌株生长特性 Mp和Sc 以共接种的形式进行混合发酵火龙果酒，各菌群变化趋势如图2所示。 在发酵前4d，非酿酒酵母Mp在总的酵母菌群中占较大的百分比，但其比例在不断降低，在发酵第8天基本上检测不到 Mp菌群，发发液中主要为 Sc，一直维持到发酵结束。而酿酒酵母 Sc 随着发酵的不断进行，其菌群数量在不断增多，在发酵的第4天，在发酵液中所占比例超过 Mp，并继续增加，在发酵第8天基本上 图2共接种发酵火龙果酒酵母菌群动态变化 Fig.2IDynamic changes of yeast population in pitaya winefermentation with co-inoculation 很难检测到Mp菌群。 2.3 pH 值、CO，释放率动态变化 龙果酒发酵过程中 pH值和 CO，释放率动态变化见图3。 图3火龙果酒发酵过程中 pH 值和 CO， 释放率动态变化 Fig.33Dynamic changes of pH and CO emission rate using Sc orMp +Se 在火龙果酒发酵过程中，CO， 释放率逐渐增大，且混菌发酵组(Mp+Sc)CO， 释放率要高于 Sc 组，在发酵的第4天达到最大值。接着逐渐降低，在第8、12、16天，两组CO，释放率基本一致(图3A)。 随着火龙果酒的发酵，发酵液pH值在发酵前期(前4d)逐渐降低，发酵中后期(4d~16d)又增加，表现出先降低后增加的趋势。但变化幅度不大。发酒初始pH值为5.0，在第4天，Sc发酵液 pH值为 3.3，Mp+Sc发酵液pH 值为3.4。发酵结束的第16天，两组发酵液pH 值均又增大到3.5(图3B)。 2.4 混合发酵火龙果酒基本理化指标 Mp与 Sc 混合发酵火龙果酒基本理化指标如表1所示。 表1火龙果酒理化指标 Table 1Physical and chemical indicators of pitaya wine 菌种 乙醇体积 pH值 总酸/ 总糖/ 挥发酸/ 编号 分数/% (g/L) (g/L) (g/L) Mp+Sc e12.43±0.123.74±0.00 3.39±0.166.19±0.41 0.63±0.05° Sc 12.55±0.783.73±0.00 0 3.23±0.06 56.63±0.66 0.74±0.04 注：*表示差异显著，P<0.05。 与商业化酿酒酒母 Sc 组相比，混合发酵火龙果酒的乙醇体积分数、pH值、总糖3个指标与 Se组发酵火龙果酒没有区别。但混合发酵火龙果酒挥发酸显著低于纯种Sc 发酵火龙果酒。 2.5 混合发酵火龙果酒感官特性 采用电子舌传感器，从从味、苦味、涩味、后味、鲜味、咸味等方面分析Mp 与 Sc 混合发酵对火龙果感官特性的影响。火龙果酒滋味属性雷达图见图4。 图4火龙果酒滋味属性雷达图 Fig.4 Pitaya wine taste attribute radar chart 结果如图4所示，混合发酵火龙果酒酸味测定值显著小于Se 纯种发酵火龙果酒(P<0.05)。其它感官数值 Mp+Sc 组与 Sc 组之间无显著区别。 2.6 混合发酵火龙果酒香气特性 采用顶空固相微萃取-气质联用方法分析Mp与Sc 混合发酵对火龙果香气特性的影响。火龙果酒中挥发性物质种类及含量见表2。 结果如表2所示，Mp+Sc 混合发酵火龙果酒中共检测出46种挥发性物质成份，包括酸类物质3种、醇类物质16种、酯类物质18种、醛酮类物质3种、烃类物质2种、其它类物质4种；Sc纯种发酵火龙果酒中仅检测到39种挥发性物质，包括酸类物质3种、醇类物质13种、酯类物质16种、醛酮类物质2种、烃类物质2种、其他类物质3种。其中在醇类物质、酯类物质、 表2火龙果酒中挥发性物质种类及含量 Table 22The aroma substances and their contents in pitaya wine 28 异戊乳酸酯 C，H030.18±0.01 0.21±0.02 29丁二酸二乙酯CHO 1.49±0.09 1.24±0.11 果香、瓜香30 辛酸乙酯 CH0： 52.52±1.4552.04±1.34香蕉、梨、花香 98 续表222火龙果酒中挥发性物质种类及含量 Continue table 2 The aroma substances and their contents in Z其它类 1.66±0.13 1.11±0.07 注：*表示差异显著，P<0.05；/表示未检测到。 醛酮类物质、其其类物质方面 Mp+Sc 混合发酵均增加了物质的种类。 尽管 Mp+Sc 混合发酵火龙果酒中酸类物质和烃类物质的种类均比 Sc 组增加，但这些类物质总量却未增加。Mp+Sc组、Sc组酸类物质总量分别为(2.84±0.14)、(2.42±0.23)mg/L，烃类物质总量分别为(0.51±0.04)、(0.34±0.03)mg/L。另外，Mp+Sc混合发酵火龙果酒中既增加了酯类物质、醛酮类物质、其他类物质的种类和含量。 醇类是酒类中含量较高的一类化合物，主要呈现出清香和清鲜香气。混合发酵增加了醇类物质种类，Mp+Sc 发酵火龙果酒中检测到16种醇类物质，比 Sc单独发酵多3种。但混合发酵并未增加醇类物质总量，相反醇类物质总量低于 Sc 纯种发酵火龙果酒，两种发酵火龙果酒中醇类物质总量分别为(27.61±1.31) mg/L和(30.46±1.72) mg/L(图5)。 图5火龙果酒中挥发性物质含量 Fig.5Contents of aroma substances in pitaya wine 高级醇，又称杂醇油，是碳原子数大于2的脂肪族醇类的统称。分析发现，Mp+Sc混合发酵火龙果酒中高级醇的含量也较 Sc 发酵火龙果酒中低。 酯类物质是各种酒中主要呈香物质之一，阈值一般较低，常具有各种花香和水果香。在2种火龙果发酵果酒中主要的酯类物质均为辛酸乙酯、己酸乙酯和葵酸乙酯，在 Mp+Sc 混合发酵火龙果酒中其占酯类物质比例分别为 49.36%、20.02%、19.35%，在Sc纯种发酵火龙果酒中其占酯类物质比例分别为51.40%、23.09%、16.59%。辛酸异戊酯、8-醇醇内酯和N-甲氧羰基-L-脯氨酸十八烷基酯是 Mp+Sc 混合发酵火龙果酒中特有酯类物质；3-甲基-2-丁烯-1-基-丁酸酯是 Sc 纯种发酵火龙果酒中特有酯类物质。混合发酵火龙果酒中酯类物质总量高于 Sc 纯种发酵火龙果酒中含量。 风味活性值(odour activity value，OAV)为香气物质浓度与该物质阈值的比值，用来评价食品中香气物质的贡献度。一般 OAV >1，认为该物质对香气成分有着突出的贡献度。反之，OAV<1，认为该物质对香气成分贡献度不大。分析了2种发酵火龙果酒中19种主要的挥发性香气物质 OAV 值，见表 4。 表4火龙果酒中主要香气物质 OAV Table4The OAV of main aroma substances in pitaya wine 序号 挥发性化合物 阈值/(pg/L) OAV Mp+Sc Sc 丁酸乙酯 81.5 11.16 5.64 乙酸异戊酯 93.93 20.76 21.40 3 己酸乙酯 55.33 384.96 422.56 4 辛酸乙酯 12.87 4080.81 4 043.51 5 壬酸乙酯 3 150.61 0.08 0.06 6 苯乙酸乙酯 1000 0.38 0.31 7 癸酸乙酯 1122.3 18.35 14.97 8 丁二酸二乙酯 100000 0.01 0.01 9 月桂酸乙酯 640 4.56 3.23 10 正辛醇 1100 0.31 0.66 11 己醇 1100 0.16 0.14 12 辛醇 40 8.5 18.25 13 苯乙醇 10 000 1.46 1.66 14 芳樟醇 15 290.67 377.33 15 香叶醇 130 10.92 16 香茅醇 180 7.39 11.22 17 α-松油醇 250 1.48 1.32 18 辛酸 500 5.68 4.84 19 己酸 420 0.88 19 己酸 420 / 0.88 注：/表示未检测到。 发现OAV>1 的物质有13种，OAV<1的有6种。在 Mp+Sc 混合发酵火龙果酒中 OAV>1的有12种，OAV 值最大的是辛酸乙酯，为4080.81，OAV<1有7种，OAV值最小的为丁二酸二乙酯，为 0.01。 3 讨论与结论 由于NSc 最初是在变质的葡萄酒中分离出来的，因此，传统观点认为其为葡萄酒酿造中的腐败菌群，一直未受到重视。但越来越多的研究表明，NSc 在葡萄酒、多种果酒的酒体形成过程中发挥积极作用，有助于增加酒体的丰富性和感官特性。因此，近年来对NSc生物多样性、酿酒特性及相关应用研究成为国内外的研究热点之一。其研究领域也由葡萄酒领域拓展到多种果酒领域，如刺梨果酒、野樱莓果酒、柿子果酒、蜜桔果酒等。但 NSc 对火龙果酒品质的影响还未知。本研究以 Mp 与 Sc 共接种的方式进行了火龙果酒的发发，以 Sc 纯种发酵为对照，结果表明，Mp与Sc 混合发酵降低了火龙果酒中挥发酸的含量，增加了挥发性物质的种类和含量，如酯类、醛酮类、烃类等，使得酒体丰富度更加复杂。 研究表明，Mp中的某些菌株可分泌多种酶类，如 果胶酶、蛋白酶、纤维素酶、-葡萄糖苷酶、亚硫酸盐还原酶、木聚糖酶、脂肪酶等，其中一些酶作用于相关底物，有助于风味物质的释放16.17-18。本研究发现，采用Mp 与 Sc 混合发酵增加了多种酯类物质的种类和含量，以及多种醇类物质的种类。这可能与Mp分泌的一些酶类相关，因此，在后续的研究中，将深入分析所用Mp 菌株酶学特性，剖析挥发性香气物质产生机理。 本研究还进一步分析了混合发酵过程中Mp菌群动态变化，发现随着发酵的不断进行，Mp在发酵菌群中所占比例逐渐降低，在发酵第4天所占比例低于 50%，在发酵的第8天开始，发酵液中很难检测到Mp菌群了。通常情况下，Mp对酒精较为敏感，对酒精的耐受性较差，随着酒精发酵的不断进行，逐渐死亡，故Mp主要在酒精发酵的前期发挥作用，产生多种挥发性物质，丰富酒体。因此，研究报道，采用Mp 与Sc 混合发酵有助于降低发酵酒的乙醇含量，可用于低度果酒的生产1。但本研究中，混合发酵火龙果酒乙醇含量与 Sc纯种发酵火龙果酒相比，未见有显著区别，可能与菌株本身特性，或者接种方式有关。 此外，Mp还可产生抗菌物质普切明(pulcherrim-in)，通过竞争性吸收环境中的铁离子，抑制其它微生物对铁离子的需求，可作为一种光谱性抗菌剂120-22。因此，在果酒生产中，采用Mp 作为生产菌种，通过生物防控，可有效抑制野生杂菌，减少二氧化硫的使用量。 综上，本研究首次分析了 Mp与Sc混合发酵对火龙果酒特性的影响。结果表明，Mp 与 Sc混合发酵可有效降低火龙果酒中挥发酸含量，增加酒体中酯类、醇类、醛酮类、烃类等挥发性物质的种类，降低了酸类、醇类物质的含量。此外，Mp与 Sc 混合发酵还降低了酸味感官特性。因此，Mp与Sc混合发酵是一种可以推荐的火龙果酒的生产方式，既增加了酒体的复杂度，又降低了同质化现象。但本研究仅分析了 Mp 与 Sc 混合发酵的一种接种方式，一种接种比例，更多的发酵方式还需要分析比较，从而确定较优的生产方式。 ( 参考文献 ： ) ( [1 ] P 1 a dil la B. 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All rights reserved. http：//www.cnki.net 摘 要：为探讨美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima， Mp） 对火龙果酒品质特性的影响，Mp 与 酿酒酵母（Saccha－romyces cerevisiae， Sc）以共接种（Mp+Sc）方式进行混合发酵，从火龙果酒基本理化指标、电子感官特性以及香气特性方面进行综合评判。同 时，分析混合发酵过程中菌株生长特性和发酵特性动态变化。结果表明，混合发酵可降低火龙果酒挥发性酸含量和酸味电子感官滋味特性，增加火龙果酒挥发性酯类、醛酮类、烃类物质种类和含量，降低挥发性酸类物质的含量。随着混合发酵的不断进行，Mp 菌群所占比例逐渐降低，在发酵后期，Sc 逐渐成为优势菌株。发酵过程中CO 2 释放率表现出先增加，然后逐渐降低的趋势；而 pH 值则相反，表现出先降低后逐渐增加的趋势。因此，Mp 主要在火龙果酒发酵前期发挥作用，与 Sc 混合发酵，影响火龙果酒的酸味特性和挥发性风味物质种类或含量。关键词：火龙果酒；美极梅奇酵母；混合发酵；品质分析；发酵特性感官检测设备：SA402B 电子舌味觉系统，日 本 Insent 公司火龙果酒感官特性测定：取 80 mL 火龙果酒样品至电子舌检测烧杯中。 按照仪器说明书步骤， 进行火龙果酒感官特性的检测。采样时间 120 s，采样速度为 1 次/s，每个样品平行测定3 次。混合发酵火龙果酒感官特性采用电子舌传感器，从酸味、苦味、涩味、后味、鲜味、咸味等方面分析 Mp 与 Sc 混合发酵对火龙果感官特性的影响。 火龙果酒滋味属性雷达图见图 4。结果如图 4 所示，混合发酵火龙果酒酸味测定值显著小于 Sc 纯种发酵火龙果酒（P<0.05）。 其它感官数值 Mp+Sc 组与 Sc 组之间无显著区别。文献来源：贵州理工学院