啤酒中赭曲霉毒素A检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA20-628Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-572 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LC-MS/MS 测定啤酒中赭曲霉毒素A含量 LCMSMS-572 摘要：本文使用岛津三重四极杆液质联用仪建立了一种 LC-MS/MS 测定啤酒中赭曲霉毒素A残留方法。样品前处理参照 《GB5009.96-2016食品中赭曲霉毒素A的测定》中的方法进行，啤酒样品经过提取后，采用免疫亲和柱进行净化，净化液浓缩后进行液质联用分析。样品在1-100 ng/mL 范围内线性良好，线性相关系数>0.999，检出限在0.1 ng/mL， 选1、10、50 ng/mL 三个浓度水平，连续6次进样保留时间和峰面积的相对标准偏差在0.104~0.288%和0.786~3.528%之间，系统精密度良好。同时考察了空白啤酒基质加标，回收率在89.2-96.8%之间，满足检测需求。 关键词：三重四极杆串联质谱赭曲霉毒素A 啤酒 赭曲霉毒素(Ochratoxins) 是一种有毒真菌代谢的产品，其中毒性最大、与人类健康关系最密切、对农作物污染最普遍的是赭曲霉毒素A (Ochratoxin A，OTA)，它广泛存在于各类食品中。研究表明该种毒素可以损害动物的肾脏和肝脏，有致畸和致癌作用，被国际癌症研究机构定为2B类致癌物。啤酒等酒类大都是以粮食为原料进行酿造的，如果酿酒的原材料受到OTA污染，则酒类制品也存在污染风险。因此，建立一种快速简单、准确、灵敏的检测啤酒中赭曲霉毒素A 的方法意义重大。 实验部分 1.1仪器 输液泵：LC-30AD×2 脱气机： DGU-20A5R 自动进样器： SIL-30AC 柱温箱：CTO-20A 1.2分析条件 目前使用的检测酒中的 OTA 主要采用的有薄层色谱法、酶联免疫吸附法以及液相色谱法，我国《GB5009.96-2016食品中赭曲霉毒素A的测定》中也规定了 LC-MS/MS 检测赭曲素毒素的方法，包括免疫亲和层析净化液相色谱法、离子交换固相萃取柱净化高效液相色谱法、免疫亲和层析净化液相色谱-串联质谱法、酶联免疫吸附测定法。 本文使用岛津超高效液相色谱仪和三重四极杆质谱联用系统，参照《GB 5009.96-2016食品中赭曲霉毒素A的测定》中的方法，建立了一种快速准确测定啤酒中赭曲霉毒素A的方法。 ( 系统控制器：C B M-20A ) 检测器：LCMS-8045 三重四极杆质谱仪 色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.99 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GIST C18 (50 mm x2.1 mml.D.，2 um， Shimadzu SGLCP/N：227-30001-02) 流相：A相-5mmol/L 甲酸铵 0.1%甲酸水溶液，B相-乙腈 流速：0.3mL/min 进样体积：3uL 柱温：40℃ 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为50%，时间程序见表1。 表1 时间程序 Time(min) Module Command Value 0.80 Pumps Pump B Conc. 50 2.00 Pumps Pump B Conc. 80 3.00 Pumps Pump B Conc. 80 3.01 Pumps Pump B Conc. 50 4.50 Controller Stop 质谱条件 离子源： ESI(+) 离子源接口电压：+4kV 雾化气：氮气3.0 L/min 干燥气：氮气10 L/min 加热气：空气10 L/min 脱溶剂管温度：250℃加热模块温度：400℃接口温度：300℃扫描模式：MRM驻留时间： 100ms 碰撞气：氩气 MRM参数：见表2 表2 MRM 优化参数 中文名 英文名 监测离子对 Q1 Pre (V) CE Q3 Pre (V) Ochratoxins A 404.10>239.10* -28 -26 -22 赭曲霉毒素A (OTA) 404.10>358.10 -28 -13 -28 注：*表示定量离子 1.3标准品与试剂 标准品：购于上海安谱，，于-20℃冰箱保存，备用。 试剂：赭曲霉毒素A免疫亲和柱 (SHIMADZU SGLC P/N： 380-05104-01)，4℃冰箱保存。 提取溶液：称取15g氯化钠和2g碳酸氢钠，加水定容至100 mL。 样品前处理 参照《GB 5009.96-2016 食品中赭曲霉毒素A的测定》中规定的方法：称取25g啤酒样品，加入50mL提取溶液，混匀后过滤，收集滤液。移取10mL滤液注入免疫亲和柱，待液体通过亲和柱后，使用15mL水淋洗1次，弃去所有淋洗液。然后用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液，于40℃下氮吹干，用1mL35%乙腈水溶液复溶，过0.22 um 滤膜后，，上机检测。 结果与讨论 3.1标准样品的 MRM 色谱图和线性范围 按照样品前处理方式处理啤酒样品得到空白基质溶液，用空白基质溶液配制1、5、10、25、50、100 ng/mL六个浓度的 OTA标准溶液，按照1.2中的分析条件进行测定，采用外标法定量。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，标准样品的 MRM 色谱图和校准曲线如图1所示。所得曲线线性关系良好，线性方程、线性范围、相关系数和检出限见表3。 图1标准品的MRM 色谱图 (1ng/mL)和校准曲线 表3 校准曲线参数 中文名称 标准曲线 相关系数r 线性范围 (ng/mL) 检出限 (ng/mL) 赭曲霉毒素A Y=7020.73X-1524.23 0.9995 1-100 0.10 3.2精密度实验 不同浓度的混合标准工作液连续进样6次，用于考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如表4所示。结果显示，保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.104~0.288%和0.786~3.528%之间，仪器精密度良好。 表4保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 名称 RSD% (1ng/mL) RSD% (10 ng/mL) RSD% (100ng/mL) R.T. Area R.T. Area R.T. Area 赭曲霉毒素A 0.288 3.528 0.212 1.410 0.104 0.786 3.3回收率实验 以空白啤酒样品进行加标回收实验，分别添加低、中、高三个浓度水平的赭曲霉毒素A标准品，计算平均回收率。啤酒基质空白样品色谱图见图2，空白基质中不含赭曲霉毒素A。加标回收色谱图见图3，各添加水平的平均回收率在87.9-96.8%之间，详见表5。 Q404.10>239.00 (+) 1.12e4 图21啤酒空白基质色谱图 图3 啤酒基质加标回收色谱图(5ug/kg) 表5 赭曲霉毒素A回收率((n=3) 名称 加标水平(ug/kg) 回收率% 89.2 赭曲霉毒素A 5 94.3 10 96.8 结论 本文使用岛津 LCMS-8045 三重四极杆液质联用仪建立了一种LC-MS/MS测定啤酒中赭曲霉毒素A残留的方法。样品前处理参照《GB5009.96-2016 食品中赭曲霉毒素A的测定》中的方法进行，啤酒样品经过提取后，采用免疫亲和柱进行净化，净化液浓缩后进行液质联用分析。赭曲霉毒素A在1-100 ng/mL范围内线性良好，线性相关系数>0.999，检出限在0.1 ng/mL， 选1、10、100 ng/mL三个浓度水平，连续6次进样保留时间和峰面积的相对标准偏差在0.104~0.288%和0.786~3.528%之间，系统精密度良好。同时考察了空白啤酒基质加标，回收率在 89.2-96.8%之间，满足检测需求。 岛津应用云 本文使用岛津LCMS-8045三重四极杆液质联用仪建立了一种LC-MS/MS测定啤酒中赭曲霉毒素A残留的方法。样品前处理参照《GB 5009.96-2016 食品中赭曲霉毒素A的测定》中的方法进行，啤酒样品经过提取后，采用免疫亲和柱进行净化，净化液浓缩后进行液质联用分析。赭曲霉毒素A在1-100 ng/mL范围内线性良好，线性相关系数＞0.999，检出限在0.1 ng/mL，选1、10、100 ng/mL三个浓度水平，连续6次进样保留时间和峰面积的相对标准偏差在0.104~0.288%和0.786~3.528%之间，系统精密度良好。同时考察了空白啤酒基质加标，回收率在89.2-96.8%之间，满足检测需求。