奶粉中黄曲霉毒素检测方案(固相萃取仪)

自动化样品前处理解决方案-RKFT-F001 解决方案 奶粉中黄曲霉毒素M1的检测 关键词 全自动固相萃取；高效液相色谱法；黄曲霉毒素M1 介绍 采用睿科Fotector Plus全自动固相萃取仪分析奶粉中的黄曲霉毒素M1，试样经热水溶解后用甲醇进行提取，提取液经离心、稀释后用含有黄曲霉素特异抗体的免疫亲和柱自动净化。用10mL水淋洗柱子将免疫亲和柱上的杂质除去，以甲醇洗脱免疫亲和柱。将洗脱液在50°C条件下氮吹干，用1mL初始流动相定容，经高效液相色谱仪上机分析。 图-1黄曲霉毒素M1的结构式 本文参考 《GB5009.24-2016食品中黄曲霉毒素M族的测定》第二法，采用免疫亲和柱净化，高效液相色谱检测，建立了奶粉中黄曲霉毒素M1高灵敏度的前处理和分析方法，得到黄曲霉毒素M1的加标回收率在88%-95%之间， RSD值小于5%。 1.仪器与耗材 仪器和耗材 睿科Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪 睿科 Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站 睿科 Auto EVA 80 全自动平行浓缩仪 高效液相色谱： Waters ACQUITY UPLC I-Class 配备大体积流通池黄曲霉毒素专用免疫亲和柱(Romer， 60mg/3mL) 试剂 甲醇(Merck，色谱纯) 乙腈 (Merck， 色谱纯) 超纯水 (Wastons) PBS盐包 2.标准曲线配置 使用睿科 Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站可实现标准品的全自动化配制，可将购买的标液(1000ng/L)通过工作站的直接稀释模式，配制成浓度为 50 ng/L 和 2ug/L的工作中间液，紧接着可通过程序设置，吸取该工作液，配置一条浓度分别为 0.05ug/L， 0.1ug/L， 0.5ug/L， 1.0ug/L， 2.0ug/L和5.0ug/L 的标准工作曲线。 序号 命令 源液位 源液浓度 源液体积(mL) 目标位 目标浓度 目标体积(mL) 溶剂 1 填充管路 3.00 水/甲醇/乙乙70/15/15 2 直接稀释 A1 1000.00 1.00 A2 50.00 1.00 水/甲醇/乙腈70/15/15 3 直接稀释 A2 50.00 1.00 A3 2.00 1.00 水/甲醇/乙腈70/15/15 4 直接稀释 A3 2.00 1.00 A11 0.05 1.00 水/甲醇/乙腈70/15/15 5 直接稀释 A3 2.00 1.00 A12 0.10 1.00 水/甲醇/乙腈70/15/15 6 直接稀释 A3 2.00 1.00 A13 0.50 1.00 水/甲醇/乙腈70/15/15 7 直接稀释 A2 50.00 1.00 A14 1.00 1.00 水/甲醇/乙腈70/15/15 8 直接稀释 A2 50.00 1.00 A15 2.00 1.00 水/甲醇/乙腈70/15/15 9 直接稀释 A2 50.00 1.00 A16 5.00 1.00 水/甲醇/乙腈70/15/15 图-2. Auto Prep 200 液体工作站配标程序 3.样品前处理 3.1样品提取 准确称取 1g 奶粉于50mL离心管中，加入4mL 50℃热水，涡旋混匀。若奶粉不能完全溶解，将离心管至于50℃的水浴中，将奶粉完全溶解后取出。待样液冷却至20℃后，加入10mL甲醇，涡旋提取 3min。在4℃条件下以 8000r/min 的转速离心10min， 取全部上清液于80mL 玻璃上样管中，加入50mL PBS 缓冲液稀释，待用。 3.2固相萃取净化条件 表-1固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科 Raykol Fotector Plus 固相萃取柱 黄曲霉毒素免疫亲和柱((Romer， 60 mg/3 mL) 淋洗 超纯水 以 2mL/min 的速度精确上样65mL 待测液， 5mL水润洗样品瓶， 5mL水淋洗免疫亲和柱，气推30mL 推干免疫亲和柱，推速为80mL/min。最后用4mL乙乙以1mL/min 的速度洗脱样品，收集洗脱液用睿科 Auto EVA80 全自动平行浓缩仪仪于50°C、气流量1L/min 的条件下吹干，用初始流动相定容至1mL，涡旋混匀，过滤膜上机分析。详细步骤见图-2。 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 体积(mL) 时间 (min) 1 清洗样品通道 乙腈 2.8 2 填充样品路径 水 40 4 1.5 特殊上样 有机废液 2 65 36.1 4 清洗样品瓶 水 有机废液 60 5 3.4 5 淋洗 水 废水 2 5 2.9 6 气推 废水 80 30 2.2 7 清洗注射泵 乙腈 60 3 0.4 8 洗脱 乙腈 收集 1 2 2.4 9 暂停 2 10 洗脱 乙腈 收集 1 2 2.4 11 气推 收集 2 2 1.4 12 气推 收集 20 10 1.3 13 结束 14 图-3.Fotector Plus 黄曲霉毒素 M1 免疫亲和柱净化方法 4.检测条件 4.1液相色谱条件 表-2黄曲霉毒素 M1 液相色谱检测条件 色谱柱 Waters BEH-C8 (2.1×100mm，1.7um) 流速 0.300mL/min 流动相 A：水，B：(甲醇：乙腈=1：1) 柱温 40°C 进样体积 10uL 梯度洗脱 等度洗脱 A：B=70：30 荧光检测器 激发波长430nm， 发射波长360nm 4.2色谱图 图-4.黄曲霉毒素M1色谱图(1g/L) 5.样品测试 取空白奶粉样品5g， 添加浓度为1ug/kg 的黄曲霉毒素M1标准品，进行上述步骤的前处理净化，样品回收率如下表-3所示： 表-3奶粉添加水平为1 ug/kg 的回收率(n=6) 名称 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 1 2 3 4 5 6 AFM1 89.3 94.6 94.7 92.2 92.1 87.9 91.8 3.0 6.结果与讨论 6.1样品提取液 pH 对回收率的影响 只用纯水稀释样品提取液进行上述净化步骤， ，[回收率没有用 PBS 缓冲液进行稀释的高，因此建议用PBS缓冲液进行稀释，调节样品环境的pH. 亲和柱内抗体的活性有影响，因此本方法采用50mL 的 PBS 缓冲汉对提取液进行稀释。 由于黄曲霉毒素在紫外光照射下不稳定，因此在实验过程中应该避免紫外光和太阳光光照射。 固相萃取进行提取液净化前，对于偏酸或偏碱性样品，建议用 PBS缓冲溶液(pH=7.4)进行稀释后过柱，否则可能会导致回收率偏低。 采用高通量全自动固相萃取仪法，准确性和重复性均满足实验要求，能够用于《GB5009.24-2016 食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定》方法对奶粉的检测。 采用睿科 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪能同时进行6个样品净化，连续自动处理60个样品，做样通量高；同时可无人值守，大幅度减少了工作人员的工作量，提高了工作效率。此外还可避免工作人员因操作失误导致的检测偏差，也可将实验人员更迭对检测结果的影响最小化。 睿科Auto Prep 200 全自动液体工作站可实现混标、标准曲线的配制，全程无需人为值守，让实验人员远离有毒有害特别是黄曲霉毒素这样的剧毒化学物质，保护身体健康。 睿科 Auto EVA 80 全自动平行浓缩仪处理通量高，80个样品可同时进行行吹，实验平行性好；而且采用氮吹针自动追随液面的设计，无需手动调节氮吹针且耗气量小，省时省力。 全自动液体样品处理工作站标曲配制 全自动固相萃取仪净化 全自动平行浓缩仪浓缩 Raykol 睿科集团股份有限公司 RayKol Group Corp.，Ltd. 网址： www.raykol.com 电话：400-885-1816 邮箱： info@raykol.com 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知◎睿科集团股份有限公司 2021年10月版 热线：址：www.raykol.com邮箱： info@raykol.com 热线：箱： info@raykol.com网址：www.raykol.com 采用睿科全自动固相萃取仪分析奶粉中的黄曲霉毒素M1，试样经热水溶解后用甲醇进行提取，提取液经离心、稀释后用含有黄曲霉素特异抗体的免疫亲和柱自动净化。