牛奶中黄曲霉毒素M1、M2的含量检测方案(液质联用仪)

SSL-CA20-418Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-523 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cnTel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn LCMS-8045 测定牛奶中黄曲霉毒素M族含量 LCMSMS-523 摘要：本文使用岛津LCMS-8045 三重四极杆液质联用仪建立了一种 LC-MS/MS 测定牛奶中黄曲霉毒素Ｍ族残留量的方法。样品前处理方法参照《GB 5009.24-2016 食品中黄曲霉毒素M族的测定》中的方法进行，牛奶样品经过甲醇提取后，采用免疫亲和柱进行净化，净化液浓缩后进行液质联用分析。两种黄曲霉毒素在0.05-5 ng/mL 范围内线性良好，线性相关系数>0.999，检出限在0.005 ug/kg， 选0.25、1、2.5 ng/mL 三个浓度水平标准工作液，连续6次进样保留时间和峰面积的相对标准偏差在0.184~0.369%和1.001~3.622%之间，系统精密度良好。同时还考察了空白牛奶基质加标，回收率在 98.2-112.1%之间。 关键词：三重四极杆串联质谱 黄曲霉毒素 牛奶 黄曲霉毒素是存在于自然界的一种霉菌毒素，具有致癌作用。目前已经报道的黄曲霉毒素有12种，包括：B、Bz、Gj、G、Mj、Mz、Pi、Q、Hj、GM、Bza和毒醇。其中黄曲霉毒素M族分为M、M， (AFTM、AFTM2)，主要存在于食用了黄曲霉毒素B、B，污染的饲料的动物的乳、肾脏、肝脏中，其中乳中最常见，具有极强的致癌性。牛奶经过巴氏杀菌后，黄曲霉毒素仍然存在，严重危害人体健康。因此，建立一种快速简单、准确、灵敏的检测乳中黄曲霉毒素Mj、Mz的方法意义重大。 目前关于奶及奶制品中黄曲霉毒素M族的检测大多只关注M}，同时检测两种毒素的报道不太多。检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、酶联免疫法(ELISA)、高效液相色谱法 (HPLC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS)。我国《GB5009.24-2016食品中黄曲霉毒 实验部分 1.1仪器 输液泵： LC-30AD×2 脱气机： DGU-20Asp检测器： LCMS-8045 三重四极杆质谱仪自动进样器： SIL-30AC色谱工作站： LabSolutions Ver. 5.96 柱温箱： CTO-20A 1.2分析条件 素M族的测定》中规定了黄曲霉毒素M族的测定方法，该标准中规定了3种检测方法，分别是同位素稀释-液相色谱串联质谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附筛查法。 本文使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A和三重四极杆质谱 LCMS-8045联用系统，参照《GB5009.24-2016食品中黄曲霉毒素M族的测定》中规定的检测方法，建立了一种可以快速准确测定牛奶中黄曲霉毒素M1、Mz的方法。 图1黄曲霉毒素M(左)、Mz(右)结构式 系统控制器：CBM-20A 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GISS C18 (100 mm x2.1 mm l.D.， 1.9um， P/N：227-30048-02， 岛津(上海)实验器材有限公司) 流动相：A相-0.2%甲酸5 mmol/L甲酸铵水溶液B相-乙腈流速：0.3mL/min 进样体积：10 uL 柱温：40℃ 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始始度为3%，时间程序见表1。 表1 时间程序 Time(min) Module Command Value 0.50 Pumps Pump B Conc. 32 4.20 Pumps Pump B Conc. 45 5.00 Pumps Pump B Conc. 100 5.70 Pumps Pump B Conc. 100 6.00 Pumps Pump B Conc. 32 8.50 Controller Stop 质谱条件 离子源：ESI(+) 脱溶剂管温度：250℃ 离子源接口电压：-1.5kV 加热模块温度：400℃ 雾化气：氮气3.0 L/min 接口温度：300℃ 干燥气：氮气5L/min 扫描模式：MRM 加热气：空气15 L/min MRM 参数：见表2 碰撞气：氩气 表2 MRM优化参数 中文名 监测离子对 Q1 Pre (V) CE Q3 Pre ((V) AFTM， 329.10>273.10* -24 -23 -20 329.10>259.10 -24 -25 -28 C1-AFT M1 346.20>317.20 -24 -22 -24 346.20>288.20* -24 -25 -32 AFT M， 331.15>273.05* -22 -23 -20 331.15>259.10 -22 --23 -28 *表示定量离子 1.3标准品与试剂 标准品：购于上海安谱，于-20℃冰箱保存，备用。 试剂：黄曲霉毒素M族免疫亲和柱，购于上海安谱，4℃冰箱保存，备用。 1.4标准系列工作液： 用乙腈配制 AFT M1、AFT Mz浓度均为100 ng/mL 的混合标准工作溶液，， 1c-AFTM浓度为 50 ng/mL的内标工作液，准确移取 AFT M1、AFTM，混合标准工作液和内标工作液适量，用初始流动相稀释成AFT M和 AFTMz浓度均为 0.05 ng/mL、0.25 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0 ng/mL的系列标准溶液，其中C17--AFT M1同位素内标浓度为 0.5 ng/mL。 1.5样品前处理 按照《GB 5009.24-2016食品中黄曲霉毒素M族的测定》中规定的提取和净化步骤进行。 结果与讨论 2.1标准样品的 MRM 色谱图 图2AFT M、AFTM标准品和内标(左、中、右，浓度均为0.5 ng/mL))2的 MRM色谱图 2.2线性范围和灵敏度 按照1.2中的分析条件对上述标准系列工作液进行测定，采用内标法定量。以浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标，绘制校准曲线，结果如图3所示。 AFT M和 AFT Mz在0.05-5 ng/mL 范围内线性关系良好，相关系数r>0.999。为了考察仪器灵敏度，选择0.05 ng/mL 浓度混合标准溶液，按照上述分析条件上机进行测定，以ASTM 作为噪音计算方法，根据S/N=3 为检出限计算的原则，计算两种毒素的检出限和定量限，结果如表3所示，满足标准中规定的检测要求。 图3：AAFTM1、AFTM校准曲线 表3 校准曲线参数 化合物名称 标准曲线 相关系数r 线性范围(ng/mL) 检出限(ug/kg) 定量限(ug/kg)) AFT M， Y=5.04402X-0.00867 0.9991 0.05-5 0.005 0.015 AFT M. Y=4.91837X-0.03895 0.9997 0.05-5 0.005 0.015 2.3精密度实验 不同浓度的混合标准工作液连续进样6次，用于考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如表4所示。结果显示，保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.184~0.369%和1.001~3.622%之间，仪器精密度良好。 表4 保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 名称 RSD%(0.25 ng/mL) RSD%(1ng/mL) RSD% (2.5 ng/mL) R.T. Area R.T. Area R.T. Area AFT M 0.369 2.899 0.207 2.681 0.184 2.363 AFT M， 0.342 3.622 0.301 2.133 0.239 1.001 2.4回收率实验 以空白牛奶样品进行加标回收实验，准确称取4g样品，分别添加三个浓度水平的标准品及相应内标，按照《GB5009.24-2016 食品中黄曲霉毒素M族的测定》中规定的前处理方法处理样品，计算平均回收率。空白样品色谱图见图4，空白基质中未检测到黄曲霉毒素M素、Mz。加标回收色谱图见图5，各添加水平的平均回收率在98.2-112.1%之间，详见表5。 图4空白牛奶基质色谱图 图5基质加标回收色谱图(0.25ug/kg) 表5AFT M1、AFT M，回收率(n=3) 名称 加标水平(ug/kg) 回收率% 0.05 102.3 AFTM 0.25 107.4 112.1 0.05 100.7 AFT M， 0.25 108.5 98.2 结论 本文使用岛津 LCMS-8045 三重四极杆贡质联用仪建立了一种LC-MS/MS 测定牛奶中黄曲霉毒素 M族残留量的方法。样品前处理方法参照《GB 5009.24-2016食品中黄曲霉毒素M族的测定》中的方法进行，该方法快速简单、灵敏度高，可供相关行业参考。 岛津应用云 黄曲霉毒素M1、M2在0.05-5   ng/mL范围内线性良好，线性相关系数＞0.999，检出限在0.005 µg/kg，选0.25、1、2.5   ng/mL三个浓度水平标准工作液，连续6次进样保留时间和峰面积的相对标准偏差在0.184~0.369%和1.001~3.622%之间，系统精密度良好。同时还考察了空白牛奶基质加标，回收率在98.2-112.1%之间。