盐水鸭中滋味变化及呈味肽分离鉴定检测方案(感官智能分析)

目 录 盐水鸭加工过程中滋味变化及呈味肽分离鉴定的研究 STUDY ON THE CHANGE OF TASTE COMPOUNDS DURINGTHE PROCESSING AND THE ISOLATION ANDIDENTIFICATION OFFLAVOUR PEPTIDES IN WATERBOILD SALTED DUCK Presented by Zheng-qing TaoSupervised by Professor Guang-hong Zhou A Thesis Submitted to Nanjing Agricultural University in Partial Fulfillment of The Requirementfor The Master Degree College of Food Science & Technology Nanjing Agricultural University Nanjing，210095， P.R.China Completed in June，2014Commencement in June，2014 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者(需亲笔)签名：商业肉 0ly年6月；12日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 保密o，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密o。 (请在以上方框内打“√) 学位论文作者(需亲笔)签名：正 ly年6月2日导师(需亲笔)签名： woiy年月2日 目录 摘 要. .ABSTRACT. II 缩写符号....i ....VII 引 言. ..IX 文献综述.C... 1 1肉品滋味研究进展.....a ..l 1.1滋味分类及其呈味物质.. ..1 1.2肉品滋味主要成分........ ..2 1.3肉品滋味形成机理..... ....3 1.4肉品滋味的影响因素. ..4 .2呈味肽研究进展...... ...6 2.1呈味肽的种类及其呈味机制 .....6 2.2肽呈味作用的特点........ ..9 2.3肽的分离与鉴定方法. ...9 .3研究目的和意义 .11 参考文献........ .13 第一章盐水鸭加工过程中滋味物质及味觉特征的变化. ...19 1材料与方法........ ..19 1.1实验材料 ..19 1.2实验方法. ..20 2结果与分析......... ..23 2.1盐水鸭加工过程中基本理化指标变化分析... ..23 2.2盐水鸭加工过程中核苷酸及其降解产物变化分析... ..24 2.3盐水鸭加工过程中游离氨基酸变化分析........... ..26 2.4盐水鸭中滋味物质的呈味作用和鲜味强度评价. ....27 2.5盐水鸭加工过程中味觉特征变化分析......... ...29 2.6盐水鸭味觉特征与滋味物质的相关性... ..32 3讨论1...... ...33 3.1盐水鸭加工过程中基本成分的变化规律.. ...33 3.2盐水鸭加工过程中核苷酸及其降解产物的变化规律....... ....34 3.3盐水鸭加工过程中游离氨基酸的变化规律..... ..34 3.4盐水鸭中滋味物质的呈味作用和鲜味强度评价... ....35 3.5盐水鸭加工过程中的味觉变化及其与滋味物质的相关性. ..35 4结论........ ..36 参考文献...amm ..37 .第二章盐水鸭中呈味肽的分离纯化及结构鉴定. ..39 1材料与方法...... ..39 1.1实验材料 ....39 1.2实验方法..... ..40 2结果与分析.. ....43 .2.1凝胶层析分离条件的选择. ....43 2.2凝胶分离组分的感官评定. ..44 .2.3凝胶分离组分的电子舌分析.. ....44 2.4凝胶分离组分的LC-MS/MS 分离鉴定 ..45 2.5化学合成肽的呈味特性分析........ ..49 3讨论........ ..51 3.1呈味肽分离条件的优化...m... .51 3.2盐水鸭中肽的呈味特性. ....52 4结论........ ..53 参考文献.... .54 全文结论......... ..57 .创新说明 ..59 研究展望... ...61 附 录........ ...63 致 谢..... ..65 .硕士在读期间发表的论文....a ....67 盐水鸭加工过程中滋味变化及呈味肽分离鉴定的研究 商i要 盐水鸭是我国传统低温肉制品的典型代表，具有皮白肉嫩、肥而不不、“鲜、香、嫩、滑”等特点，深受国内外广大消费者的喜爱。传统的盐水鸭加工制作多以手工作坊式为主，要求“炒盐腌、老卤复、烘得干、煮得足”。盐水鸭的现代工业化生产则对传统工艺进行了继承和改造。-干腌、复卤、冷藏、煮制是盐水鸭工业化生产的主要工艺点，对盐水鸭成品的品质和风味有重要的影响。 本论文以不同工业化加工阶段的盐水鸭为原料，研究盐水鸭在加工过程中基本成分和滋味物质的变化，结合电子舌技术分析了不同加工阶段盐水鸭的具体味觉特征差异；并对盐水鸭成品中呈味肽进行了分离纯化和鉴定。具体研究内容和结果如下： 1盐水鸭加工过程中滋味物质及味觉特征的变化 分析了原料鸭、干腌、复卤、冷藏和煮制这五个工艺点处盐水鸭的基本成分和滋味物质含量，并采用滋味活性值(TAV)和等鲜浓度(EUC) 来评价这些滋味物质的呈味作用和鲜味强度。结果表明，盐水鸭在加工过程中水分含量呈下降趋势，蛋白质含量在煮制前加工过程中变化不大，煮制后显著增加。盐水鸭的 NaCl 含量和 pH值，对其咸味和鲜味的感官特性影响较大。盐水鸭煮制前风味核苷酸(5'-肌苷酸、5'-鸟苷酸、5'-腺苷酸)含量呈持续下降趋势，而煮制后含量显著升高，肌苷和次黄嘌呤的变化规律与其相反；游离氨基酸在干腌阶段含量下降，复卤阶段含量上升，冷藏和煮制阶段含量显著下降。复卤和煮制工艺对滋味物质的变化影响最为显著，是盐水鸭加工的关键工艺点。盐水鸭成品中的核苷酸类物质以5'-肌苷酸(233.34 mg*100g)和肌苷(174.33 mg100g)为主，，占总量的47.33%；主要游离氨基酸为牛磺酸(212.37mg*100g)、谷氨酸(96.66 mg*100.g)和丙氨酸(95.52 mg100l.g).5-肌苷酸和谷氨酸的 TAV 值大于1，对盐水鸭的滋味有直接的贡献。盐水鸭的等鲜浓度为3.89 g MSG·100g，说明盐水鸭有强烈的鲜味强度。 采用 TS-5000Z 味觉分析系统测定了盐水鸭加工过程中的咸味、鲜味、酸味、苦味、涩味以及各种回味的味觉指标，并分析了味觉与滋味物质的相关性。结果表明，盐水鸭在加工过程中咸味变化最显著，在干腌、复卤和冷藏过程中咸味显著升高，煮制后咸味又显著下降；鲜味在原料鸭中最强，在干腌、复卤和冷藏过程中均显著下下，煮制后鲜味又显著上升；丰富度在冷藏和煮制阶段显著上升，煮制后达最大值。盐水鸭加工过程中，酸味、苦味和涩味这些不良滋味呈下降趋势，煮制后盐水鸭成品的酸 味、苦味和涩味均处于较低水平。 2盐水鸭呈味肽的分离纯化及结构鉴定 采用分级超滤、葡聚糖凝胶过滤层析等一系列方法对盐水鸭中的呈味肽进行分离纯化，结合感官评定、电子舌和液质联用技术对呈味肽组分进行筛选和鉴定，并采用多肽固相合成方法合成三条目标呈味肽，对其进行呈味特性研究。结果表明，盐水鸭的小肽提取液经超滤和凝胶层析分离后得到5个分离组分(F1、F2、F3、F4和F5)，经过感官评定和电子舌分析后发现 F1组分的稀释因子最高，达128，且与超滤组分(F)的滋味特征相似。采用液质联用对呈味特性最强的F1组分进行分离鉴定，得到7条由6~9个氨基酸残基组成的肽链，其中3条肽链可信度和相对离子强度较高，被鉴定为主要呈味肽，其氨基酸序列分别为Gly-Pro-Asp-Pro-Leu-Arg-Tyr-Met(GPDPLRYM)、Asp-Pro-Leu-Arg-Tyr-Met (DPLRYM) 和 Val-Val-Thr-Asn-Pro-Ser-Arg-Pro-Trp (VVTNPSRPW)。 以鉴定得到的三条呈味肽为目标肽进行固相化学合成，分别得到三个合成肽F1T3、F1T5 和F1T7。电子舌分析发现， F1T3与盐水鸭的总体滋味最接近，呈味特性最接近鲜味，最有可能是盐水鸭的特征呈味肽； F1T5和F1T7滋味相近，与盐水鸭总体滋味差异性相对较大，呈味特性最接近咸味； F1T3、F1T5和F1T7 的酸味和甜味均较弱。三条合成肽均能与 MSG 发生协同作用增强咸味，但与 NaCl 没有鲜味增强作用。 关键词：：盐水鸭；加工；滋味；呈味肽 STUDY ON THE CHANGE OF TASTE COMPOUNDS DURINGTHE PROCESSING AND THE ISOLATION ANDIDENTIFICATION OF FLAVOUR PEPTIDES IN WATERBOILD SALTED DUCK ABSTRACT Water boiled salted duck is one of the low temperature cooked meat products intraditional Chinese meat products. It is famous for its delicate processing， savoury， andtender flavour. In resent years， modern industrial processing method has been applied inwater boiled salted duck instead of the traditional manual workshop-based manufacture.Dry-curing， brining， cold storage and boiling are the main process in industrial production，which also make a great contribution to the flavor of ducks. The aim of this research is to investigate the effects of process on the taste of waterboiled salted duck meat and clarify the key flavour peptides that account for the delicioustaste， so as to provide a theory basis for studying and accommodating the flavor， improvingthe processing technology of water boiled salted duck. The contents and results are asfollows. 1. The change of taste compounds and taste properties of water-boiled salted duckduring the processing During the processing of water-boiled salted duck， the water content of duck showed adecrease tendency during the processing. The protein content had no significant changesbefore the process of boiling， but largely increased during the boiling. The lower pH valueand suitable salt content of water-boiled salted duck were largely contributed to the saltnessand umami sensory property. The main taste compounds of water-boiled salted duck during processing， includingnucleotides and related compounds， free amino acids were analyzed by high performanceliquid chromatography(HPLC) and amino acid auto-analyzer. Furthermore， taste impact ofthe main taste compounds was evaluated by taste active values (TAVs) methods； umamiintensity of water-boiled salted duck was evaluated by equivalent umami concentration(EUC) methods. Results showed that the special processes， brining and boiling， producedan increasing effect on the taste compounds， which could be the reason for the savoury taste of water-boiled salted duck. 5'-Ionosine-monophosphate(5'-IMP) and Inosine(I) were themajor nucleotides， accounting for 47.33% of the total nucleotides and related compounds.Taurine(212.37 mg100g)， Glutamic acid(96.66 mg100g) and Alanine(95.52mg100l.g) were the major free amino acids. The TAV values of 5'-IMP and glutamic acidwere greater than one， and they had strong taste impacts on the duck meat flavour. TheEUC was 3.89 g MSG100.gduck meat， which meant that the umami taste of water-boiledsalted duck was very intense. The taste properties of water-boiled salted duck during processing， including saltiness，umami， sourness， bitterness， astringency and richness were detected by TS-5000Z tasteanalysis system. Results showed that saltiness of water-boiled salted duck changed mostsignificantly during the processing， it continuously increased during dry-curing， brining andcold storage， but significantly decreased during the boiling. The umami taste of raw duckwas the most intense， and it significantly decreased before the process of boiling， butlargely increased during the boiling. Richness had no significant changes before coldstorage， but significantly increased during the cold storage and boiling. The bad tasteproperties， sourness， bitterness and astringency showed a decrease tendency during theprocessing. 2. Isolation and identification of flavour peptides from water-boiled salted duck To clarify the key flavour peptides that account for the savoury taste of water-boiledsalted duck， this study was performed to examine flavour peptides extracted from the meatof water-boiled salted duck. Peptides fractions (F1， F2， F3， F4 and F5) were purified froman aqueous extract of duck muscle by ultrafiltration and Sephadex G-15 gel filtrationchromatography. Fraction F1 was identified to have the most intense taste through sensoryevaluation analysis and electronic tongue determination. Totally 7 peptides in F1 fractionwere further separated and identified by Nano-LC-ESI LTQ-Orbitrap MS/MS. Three keyflavour peptides were identified as Gly-Pro-Asp-Pro-Leu-Arg-Tyr-Met(GPDPLRYM)，Asp-Pro-Leu-Arg-Tyr-Met(DPLRYM)and Val-Val-Thr-Asn-Pro-Ser-Arg-Pro-Trp(VVTNPSRPW) for the higher ALC% and signal strength of peptide ions. The three identified peptides were synthesized by solid-phase synthesis， named F1T3，F1T5 and F1T7， respectively. The taste properties of three synthesized peptides wereevaluated by electronic tongue. The taste location between F1T3 and F1 was the closest followed by F1T3 and ultrafiltration fraction (F). This suggested that F1T3 had a similartaste with the total extract from water-boiled salted duck. For taste， F1T3 was close toumami， while F1T5 and F1T7 were close to saltness. The results showed that these threekey flavour peptides could be important components of the savoury taste of Nanjing cookedduck. Key words：Water-boiled salted duck； Process；s； Taste； Flavour peptides 缩写符号 缩写 英文名称5'-ADP 5'-Adenosine diphosphate5'-AMP 5'-Adenosine monophosphate5'-GMP 5'-Guanosine monophosphate5'-IMP 5'-Inosine monophosphateALC Average local confidenceATP Adenosine triphosphateBAA Bitter amino acidBMP Beefy meaty peptideEUC Equivalent umami concentrationsFAA Free amino acidGC-MS Gas chromatograph-mass spectrometryHPLC High performance liquid chromatographyHx Hypoxanthine.InosineLC-MS Liquid chromatography-mass spectrometryMS Mass spectrometryMSG Monosodium glutamateOAA Other amino acidPCA Principal components analysisSAA Sweet amino acidSEC Size-exclusion chromatographyTAV Taste active valueTD Taste dilutionTDA Taste dilution analysisUAA Umami amino acidUF Ultra filtration 中文名称 5'-二腺苷磷酸 5'-腺苷酸 5'-鸟苷酸 5'-肌苷酸 可信度 三磷酸腺苷 苦味氨基酸 牛肉美味肽 等鲜浓度 游离氨基酸 气质联用 高效液相色谱 次黄嘌呤 肌苷 液质联用 质谱 谷氨酸单钠盐 其他氨基酸 主成分分析 甜味氨基酸 体积排阻色谱 滋味活度值 稀释值 滋味稀释分析 鲜味氨基酸 超滤 UPLC Ultra performance liquid chromatography 超高效液相色谱 20种氨基酸 A Ala Alanine 丙氨酸 R Arg Arginine 精氨酸 N Asn Asparagin 天终酰胺 D Asp Aspartic acid 天冬氨酸 C Cys Cysteine 半胱氨酸 O GIn Glutamin 谷氨酰胺 Glu Glutamic acid 谷氨酸 G Gly Glycine 甘氨酸 H His Histidine 组氨酸 Ile Isoleucine 异亮氨酸 L Leu Leucine 亮氨酸 K Lys Lysine 赖氨酸 M Met Methionine 甲硫氨酸 F Phe Phenylalanine 苯丙氨酸 P Pro Proline 脯氨酸 S Ser Serine 丝氨酸 Thr Threonine 苏氨酸 W Trp Tryptophan 色氨酸 Y Tyr Tyrosine 酪氨酸 中文名称 引 言 南京盐水鸭是中国特色肉制品中仅有的几种低温肉制品之一，颜色洁白、组织细嫩、口感滑润、风味独特。南京人素有“无鸭不成席”之说，盐水鸭历史悠久，古有“六朝风味，白门佳品”之誉，可称南京一绝。南京有上千年养鸭、制鸭、吃鸭的历史，蕴育了一大批肉鸭系列名牌产品，这些产品在为企业带来丰厚回报的同时，也促进了南京及周边地区鸭业经济的发展，现南京年销熟鸭制品突破3000万只。但传统的生产工艺方式过分依赖于主观感受，对产品的卫生、安全、营养及包装保鲜和消费的多样性方便性带来极大的问题，难以适应现代消费观念和要求，已成为限制其产业发展的关键因素。如何在现代化生产工艺下保持传统特色肉制品优良风味是研究的关键。 风味是评价肉品品质的重要指标，更是消费者购买产品的首要选择，因此成为现在的研究热点。目前，在盐水鸭风味研究方面已有诸多报道，对盐水鸭挥发性风味物质和老卤成分已有比较系统的研究，但对盐水鸭中的滋味物质及其呈味评价的研究相对较少；传统加工工艺对盐水鸭风味的影响已有报道，但工业化加工过程对盐水鸭风味的影响研究较少；风味前体物质及滋味成分的研究集中于核苷酸类、游离氨基酸、游离脂肪酸、还原糖及硫胺素等，对盐水鸭中呈味肽的研究还是空白。 本课题的目标是通过研究盐水鸭工业化加工过程中滋味物质及呈味特性的变化，揭示滋味的变化规律和形成机理，同时对盐水鸭成品中的呈味肽进行分离纯化和鉴定，旨在为盐水鸭风味研究体系的完善、传统工艺的改进和调味料开发提供理论依据。 文献综述 1肉品滋味研究进展 风味 (Flavor)是肉品的重要食用品质之一，也是消费者评价肉品品质最常用的指标之一。根据国家感官分析术语标准(GB10221.2-88)规定，食品风味是指品尝过程中感受到的嗅觉、味觉和三叉神经感的复合感受，它还可能受触觉、温觉、痛觉或动觉效应的影响。风味主要包括气味 (Odor) 和滋味 (Taste)：气味主要是由肌肉在加热过程中产生的挥发性风味物质如不饱和醛、酮、含硫化合物以及一些杂环化合物组成；滋味主要来源于肉品中的滋味呈味物质如游离氨基酸、核苷酸及其代谢产物、小肽和无机盐等“。气味和滋味共同影响食品最终风味的形成，两者密切相关，缺缺不可。由此可见，对于食品风味的研究评价，受诸多因素的影响，涉及生物、化学、物理、生理、心理等多门学科，是一个相当复杂和困难的研究领域2。 肉品风味研究工作的起源被公认为是1865年德国 Liebig 肉类提取公司的成立。有关肉品风味的早期研究源于上个世纪五十年代，主要研究了风味的前体物质；六十年代初期随着色谱和波谱技术的逐步完善，人们对风味的研究又转向挥发性的风味化合物。与香味、质地等感官指标相比，滋味是肉制品主要的感官特性4。本文着重介绍肉品滋味的研究进展，主要包括滋味成分的种类、滋味形成机理以及影响肉品滋味的因素等。 1.1滋味分类及其呈味物质 滋味是食品中可溶性成分溶于唾液或食品的溶液刺激舌表面的味蕾，再经过味觉神经传入神经中枢，进入大脑皮质，产生的味觉。自古以来，人们就试图对滋味进行分类，到19世纪把基本味分成酸、甜、苦、咸四种。早期研究中并并有将鲜味当成基本味的一种，英语中也没有相应的单词，鲜味通常被称为"flavor potentiatingactivity (风味增强作用)”。后经大量的实验表明，在人的味觉细胞中存在感知鲜味的特异性受体，且这种受体蛋白只与鲜味物质结合，另外还存在只传递鲜味信息的单一味神经，因此鲜味就符合作为基本味的条件，现在也已经有表示鲜味的单词“umami”，并作为国际通用语(。因此，目前公认的基本味有5种：酸、甜、苦、咸、鲜。各类滋味的呈味物质见下表： 表1主要呈味物质 Table1Main taste compounds 滋味属性 呈味物质 甜味 糖类：葡萄糖、果糖、核糖 氨基酸类：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、脯氨酸 咸味 无机盐类、谷氨酸单钠盐、天门冬氨酸盐 酸味 酸类：琥珀酸、乳酸、吡咯烷酮羧酸、磷酸 氨基酸类：天门冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、天冬酰胺 苦味 肌酸、肌酸酐、次黄嘌呤、鹅肌肽、啡肽、其他苦味肽等 氨基酸类：蛋氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、组 鲜味 氨酸 谷氨酸、谷氨酸钠、天冬氨酸钠、琥珀酸钠、肌苷酸、鸟苷酸 某些鲜味肽(谷氨酸天冬氨酸、谷氨酰谷氨酸、谷氨酰丝氨酸等) 1.2肉品滋味主要成分 对深色肉的研究结果显示，肉品中的滋味呈味物质主要是氨基酸、小肽、核酸代谢产物及无机盐，这一结果对同样适用于禽肉类8。目前，国内外对肉制品滋味研究报道较多的是干腌火腿和海鲜产品。Ruiz等t、Martin等和Hernandez-Cazares等[10]的研究表明，小肽和游离氨基酸是干腌火腿滋味物质的核心成分，而火腿中的核苷酸类物质因为生产周期较长几乎完全代谢。竺尚武等、赵改名等"2和党亚丽等3]对我国金华火腿的滋味研究发现，火腿中无机盐赋予火腿咸味，同时还是鲜味物质的助鲜剂；火腿中主要的有机酸是乳酸；对火腿滋味贡献大的氨基酸有Glu、Asp、Ala、Val、Lys和Met等；火腿中提取出的肽大部分是相对分子质量小于1000的肽，它们共同作用形成了火腿独特的鲜甜滋味。Noguchi等14)在酶解鱼肉蛋白的混合物中发现了许多具有鲜味的二肽和三肽。翁世兵等151对海鲜产品的鲜味物质的研究综述表明，鱼、虾、蟹、贝等典型海产品的主要特征滋味物质是谷氨酸、甘氨酸、5'-肌苷酸(IMP)和5'-腺苷酸(AMP)等。 对于禽肉制品， Liu等16)比较了不同加工方式鸭肉制品的滋味物质，发现鲜味氨基酸Glu和Asp以及风味核苷酸5'-肌苷酸(IMP)和5'-鸟苷酸(GMP)对鸭肉制品的滋味贡献显著，烤鸭和盐水鸭中的风味核苷酸含量甚至可以与一些蘑一媲美。李家胜等[17]和吴锁连等118等测定了鸡肉中的核苷酸降解产物，结果表明肌苷酸(IMP)含量最高，占总核苷酸代谢产物的大部分，是鸡肉中重要的滋味物质。李艳逢等9研究了南京盐水鸭卤水中的滋味物质，发现卤水中的主要滋味物质是游离氨基酸，包括谷氨酸、天 门冬氨酸、丙氨酸等，老卤中的游离氨基酸含量显著高于新卤，对盐水鸭滋味的贡献更大。 1.3肉品滋味形成机理 肉品中主要滋味成分包括游离氨基酸、小肽和核苷酸三大类物质。肉品的加工过程相当复杂，涉及到许多生化反应，如肌肉蛋白在内源酶和热变性作用下，生成大量的肽类物质和游离氨基酸；；三磷酸腺苷(ATP)在一系列酶的作用下转化成IMP、GMP等滋味核苷酸。 游离氨基酸和肽类是肉品中重要的滋味物质，由肉中蛋白质在内源蛋白水解酶作用下分解产生。肉品中蛋白质的水解反应一般分为以下步骤：首先，主要肌肉纤维蛋白，在组织蛋白酶、钙蛋白酶的作用下初步降解，形成分子量中等的多肽物质；然后，多肽在肽酶的作用下降解成小肽；最后，小肽在二肽酶、三肽酶和氨肽酶的作用下，生成分子量更小的小肽和游离氨基酸(20)。 游离氨基酸和肽的味感取决于分子结构中的亲水基和疏水基。亲水基与鲜味、甜味等诱人风味相关，而疏水基与苦味等令人不愉快的风味相关。吕雪娟等娟21在研究蛋白水解的过程中发现，随蛋白酶解度的增大，游离氨基酸的疏水性增大，蛋白水解液的味道逐渐变苦，且水解液综合味感值与游离氨基酸的综合疏水性之间存在极显著的负相关。 核苷酸及其代谢产物是食品鲜味的重要来源之一，大多数动物性食物(如牛肉、猪肉、鸡肉和干鲣鱼)中都含有大量的IMP，甲壳类和软体类原料(如鲍鱼、龙虾、乌贼等)主要含有AMP； GMP主要存在于植物中，在蘑菇中含量很高，在动物性食物中含量较少，但对肉品鲜味也有不可忽视的作用用。呈味核苷酸主要是由肌肉中的ATP降解产生的。动物在宰后成熟阶段，体内的ATP按以下途径分解： 三磷酸腺苷(ATP)二磷酸腺苷(ADP)；肌激酶一磷酸腺苷(AMP)- 途径A 肌苷酸(IAMP 脱氨酶MP酸酯 卡肌苷(HxR)核苷酶次黄嘌呤(Hx)+核糖途径B十：腺嘌呤核苷腺苷A脱氨MP 脱氨基酶酶 一般来说，，畜禽类、鱼类经过途径A；甲壳动物，如虾、蟹类则经过途径A和B；软体动物，如贝类和章鱼则经过途径B[22]。 很多滋味物质在赋予食品独特滋味的同时，也是风味前体物质，参与肉品香味的形成，包括肽类、氨基酸、碳水化合物和核苷酸等。在加热过程中，氨基酸和碳水化 合物(主要是还原糖)发生美拉德反应，生成大量挥发性风味成分。 1.4肉品滋味的影响因素 1.4.1畜禽种类和部位 不同品种的畜禽肉类具有特殊的风味感官特性，这是由其遗传基因决定的(23。即使是同一类型的动物，由于品种、性别等其它因素，肉的风味也有差别。研究表明，肉制品的滋味在种间无明显质的不同，只是在强度上有一定的差异；但对同种动物的不同部位来说，滋味物质含量可能不同，从而引起滋味的差异性。Macy等124)的研究发现，牛、猪、羊等的的水提物中的小分子物质非常相似，且糖、氨氮化合物和核苷酸类物质在加热时的变化趋势一致，仅在含量上有一些差异。Madruga等I25]测定了不同肉中的IMP及其衍生物的含量，发现猪肉、牛肉和羊肉中的IMP含量依次为97.0mg100l.g、69.3mg100.g和108.2 mg100.g.Chen等26研究发现，不同部位的鸡肉中IMP的含量不同，鸡胸肉中的IMP含量为456 mg100.g，腓骨肌中的IMP含量为298mg·100g. 1.4.2加工方式 肉品的加工方式，包括主要加工工艺、加工周期、加热方式、烹饪温度、腌制剂使用、pH等，会直接影响肉品的滋味，这点在传统肉制品中表现尤为突出。 刘源等127等比较了不同加工工艺对鸭肉的滋味成分影响，结果表明盐水鸭和烤鸭中的鲜味氨基酸Asp、Glu和甜味氨基酸Ala含量显著高于水煮鸭，风味核苷酸含量最高的是烤鸭，其次是盐水鸭，水煮鸭中的含量最少。何晓峰等128)研究瓦罐鸡汤主要滋味物质时，发现传统工艺的瓦罐鸡汤滋味优于现代采用高压熬制和电磁炉熬制的鸡汤，原因在于陶瓷瓦罐受热均匀，且有助于核苷酸和游离氨基酸的富集。Ruiz等对伊比利亚干腌火腿的非挥发性风味物质研究发现，不同的熟成时间(传统工艺：600天，优化工艺：420天)对滋味物质变化的影响显著，在420天到600天的成熟过程中，大部分游离氨基酸含量减少，而总肽和一些小肽含量增加。Flores等29对“Serrano"腌火腿的研究发现，干制周期12个月的火腿中肽和游离氨基酸的含量均显著高于千制周期7个月的火腿。 烹调温度也会影响肉品的滋味物质的含量。温度对滋味物质含量的影响包括两方面：一是影响肉品基本成分降解生成滋味物质的速度；二是影响滋味物质的分解速度。Spanier等[30]研究温度对某些水解酶活性的影响时指出，内源酶特别是蛋白水解酶和糖苷酶在肉品滋味物质生成过程中发挥重要的作用，在20-80℃内，酶活随温度的变化而变化，一些酶如组织蛋白酶、过氧化氢酶在70℃以上都能保持较高的活性。鲜肉 滋味的改变主要发生在68℃；在70℃时，小肽含量急剧增加，其中多数肽是滋味呈味物。Martin等B3比较了传统工艺T(高盐，温度较高)和现代工艺M(低盐，温度较低)干腌火腿时，发现氨基酸含量与温度呈正相关，而食盐含量与特征游离氨基酸含量呈负相关，肽类物质的变化趋势与游离氨基酸类似。 腌制是肉制品的常用加工方式，常用腌制剂有食盐、硝酸盐、亚硝酸盐和抗坏血酸。其中，氯化钠是最主要的腌制剂，可以促进或抑制相关酶的酶活。除了m-钙蛋白酶和氨肽酶B以外，组织蛋白酶和氨肽酶的酶活均受氯化钠的抑制作用，尤其在高浓度条件下。在氯化钠浓度低于0.5 molL"'时，m-钙蛋白酶仍会被激活；氨肽酶B是氯离子激活酶， 0.35 mol.L"'氯化钠可以使氨肽酶B的酶活增加3倍[32]。硝酸盐和亚硝酸盐对酶活无明显的抑制作用；抗坏血酸对蛋白酶H、亮氨酰氨肽酶和m-钙蛋白酶有轻微的抑制作用。氯化物对肉制品品质也起着重要的作用，如果氯化物使用量过大，将直接危害到消费者的健康，但也并不是用量越少对肉制品越有益。Toldra等132)的研究表明，氯化物的减少可以增强干腌火腿中蛋白水解酶的酶活，从而导致火腿组织过度软化，影响火腿的滋味和口感。 1.4.3二次杀菌方式 为了减少肉品中有害微生物的数量，延长产品的货架期，近年来来业上在肉制品包装后广泛使用不同方式进行二次杀菌，如巴氏杀菌、超高压杀菌、微波杀菌和辐照杀菌等。有研究表明，大多数肉品加工企业采用低于100℃的二次杀菌方式，而高温二次杀菌方式(如121℃)虽然杀灭了肉品中几乎所有的微生物，但它容易引起肉制品感官特性很大程度地恶化，如产生蒸煮味(WOF) 等异味、肉汁大量渗出等不良现象[33-35]。一般来说，当肉品中心温度达到70℃时，，-一般致病菌即可杀灭，而肉制品的风味、口感及组织构态基本不受影响(36]。 Dai等(37比较了不同加热温度(99℃、108℃和121℃)和微波杀菌方式下的盐水鸭滋味物质变化，发现对照组和99℃盐水鸭口味更清淡爽口，而高温组(108℃、121℃和微波组)盐水鸭中含有更多的鲜味物质和相对较少的苦味物质(次黄嘌呤和肌苷)。靳烨等38用250MPa的压力处理牛肉10 min后，发现超高压处理后牛肉的嫩度显著提高，且游离氨基酸的含量增加，但随着贮存时间的延长作用逐渐消失，到第7天时游离氨基酸的含量与对照组无差异。 1.4.4滋味物质之间的相互作用 很多研究发现，肉制品中的滋味物质含量大部分都低于各自的阈值，因此各种滋味物质的协同作用可能是决定肉滋味的最重要因素。目前比较明确的协同作用是核苷 酸(IMP和GMP)和MSG之间的作用，Maga等139报道，按1：1比例混合的MSG-IMP产生的味觉强度比等量的MSG 增强7倍，按1：1比例混合的 MSG-GMP 产生的味觉强度比等量的 MSG 增强30倍， 且 MSG 与 IMP 的协同效应在1：1时是最明显的。目前工业上已经根据此原理生产复合特鲜味精，比例通常为 MSG：IMP：GMP=95：25：25，可产生味觉强度接近于6倍的协同效应。Fuke等40)研究发现AMP 和 IMP之间也存在协同作用，低浓度(50-100 mg100"mL')的 AMP只提供甜味，不提供鲜味，但当样品中存在少量 IMP 时，甜味也会增强，同时会产生鲜味和复合滋味。Woskow41的研究表明，5'-核苷酸钠盐(具有咸味特征)具有增强甜味的效果，在中等浓度时能提高咸味而抑制酸味和苦味。Kemp 等42)研究表明，中等浓度的谷氨酸钠(MSG)对甜味和苦味有抑制作用，高浓度的 MSG 对氯化钠有咸味增强作用； MSG和腺苷单磷酸盐都可以起到抑制苦味的作用。有些肽也能发挥滋味协同作用，如谷氨酸寡肽，就是很好的苦味掩盖剂[43]。 2呈味肽研究进展 呈味肽是指从食物中提取或者由氨基酸合成的对食品风味具有一定贡献的小分子肽[44]。呈味肽广泛存在于肉类、蔬菜和水果等各种食物中，不仅能产生特征滋味，还可以作为风味前体物质参与美拉德反应，产生芳香的气味[45]，因此通常所说的各种肽的呈味作用是其综合效果。20世纪60年代以来，肽的呈味特性越来越引起学者的关注，陆续从奶酪[46]、酒[47]、肉[48]等多种食物中分离鉴定得到确定序列呈苦、鲜、酸、咸、甜等味的呈味肽和未知呈味特性的呈味肽。本文综述了目前国内外对呈味肽的研究进展，主要包括呈味肽的种类及呈味机制、呈味特点和分离鉴定方法等，以期为食品风味研究及调味品的开发提供理论基础。 2.1呈味肽的种类及其呈味机制 2.1.1甜味肽 对甜味肽的研究是从二肽衍生物阿斯巴甜(L-天门天氨冬-L-苯丙氨酰甲酯，Aspartame)的发现开始的。二肽衍生物要具有甜味，其构成二肽的氨基酸必须均为L型；肽链的N端必须是天冬氨酸，而且它的X-COOH 和 A- NH2 均为游离基； 二肽衍生物的甜度随其分子量的增大而降低[49]。Mazur 等I50]对阿斯巴甜的结构研究表明，ASP 有决定性作用，不能被其他任何氨基酸残基取代，而 Phe 可被一些非疏水性氨基酸残基替代，如 H-Asp-Tyr-OMe 比阿斯巴甜的甜味略低， H-Asp-Met-OMe 接近甜味，而 H-Asp-Trp-OMe 无甜味。 目前，关于甜味肽方面的研究已经比较成熟，如阿斯巴甜(L-天门冬氨酰-L-苯丙 氨酰甲酯， Aspartame)和阿力甜(L-天门冬氨酰-D-丙氨酰胺， Alitame)等，因其具有甜度高、热量低、化学结构稳定的特点，已经作为功能性甜味剂广泛应用与食品和医药领域5I。目前各国学者正在积极探索从天然食品中开发新的低聚肽甜味剂，如甜味赖氨酸二肽(N-Ac-Phe-Lys、N-Ac-Gly-Lys)、Pentadin、Curculin、Monellin、Thaumatin和 Mabinlin 等[52-53]。 2.1.2苦味肽 苦味肽常见于奶酪、酱油、酒曲及火腿等发酵、腌制食品中，尤其在发酵过程中会产生大量的苦味肽54]，因此发酵食品的苦味往往与其发酵过程中蛋白质降解产生的苦味肽有关。研究表明，肽的苦味来源于肽链中的疏水性氨基酸，如 Arg、 Leu、 Phe和 Pro， 水疏水残基是苦味受体的结合位点(55]。肽链中的疏水性氨基酸没有被包藏在分子内部，而暴露在外时，接触味蕾便会产生苦味，疏水性氨基酸侧链暴露程度越大，苦味越强[56]。多肽中疏水性氨基酸置于 C端，而亲水性氨基酸置于 N 端是产生苦味的主要原因之一[57。此外，氨基酸序列的顺序对苦味也有重要影响，如 Otagiri 等1581对疏水性氨基酸残基的研究表明， 当Arg 与 Pro 相连(如 Arg-Pro， Arg-Pro-Gly 和Gly-Arg-Pro)时会产生强烈的苦味。 苦味虽然一般被认为是不好的风味，但在咖啡、啤酒或干酪等食品中却是非常重要的呈味特性，而且有些苦味肽还具有一定的生理功能，起到预防慢性疾病的作用。Upadhyaya 等154和 Pripp 等15研究表明，某些二肽和三肽(Phe-Phe-Phe， EC50微量)与血压调节蛋白血管紧张素转化酶(ACE)具有相同靶受体，能竞争性抑制血管紧张素转化酶的作用，具有抗高血压的作用。 2.1.3鲜味肽 鲜味肽又名美味增强肽，是可以补充或增强食品原有风味的肽类物质。当这些肽的含量低于其阈值时，仅起到增强风味的作用；当含量高于其其值时，产生鲜味。鲜味肽不影响其它味觉(咸、酸、甜、苦)，且能增强其各自的风味特征，在各种蔬菜、肉、禽、乳类、水产类乃至酒类食品中都有很好的增味效果。 1978年， Yamasaki 等159从木瓜蛋白酶处理后的牛肉中分离出具有“鲜美味”的牛肉辛八肽 Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala(BMP)，因其具有增强牛肉风味的功能，故被称为牛肉美味肽、美味提升肽，首次证明肽可以让食品变得更美味。国外学者采用化学合成法合成了 BMP， 发现它具有很强的鲜味，且能与食盐、MSG、IMP 和GMP产生较好的协同作用(60]。Nishimura 等161]对鱼蛋白水解产物进行研究，发现了呈鲜味的小肽 Glu-Glu、Glu- Ser、Thr-Glu、Glu- Asp、Ser-Glu- Glu、Asp- Glu- Ser 等。Su 等I62]研究发现，1000-3000的小分子肽对花生粕酶解液的鲜味有重要贡献，分离鉴定得 到 两 条 鲜 味 增 强 肽 Ser-Ser-Arg-Asn-Glu-Gln-Ser-Arg 和Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Pro-Asp-Gly-Ser-Ser-Arg。肽的鲜味一般较味精要弱，不像味精、核苷酸那样以鲜味为主，而是赋予食品所谓的可口可乐味，形成复杂微妙的味感[6] 研究发现，鲜味肽的氨基酸序列中一般包含 Glu 或 Asp 等亲水性氨基酸[63]。鲜味肽的定味基是其分子两端带负电的功能团-COOH， 助味基是具有一定亲水性的一OH、a-L-NH2等。鲜味肽必须具有带正电分子团，带负电分子团和含亲水性残基分子团，且3种分子团分别接到相对应的感受器位置，才能让人感受到鲜味I64]。 2.1.4酸味肽 肽的酸味往往与鲜味密切相关。Kirimural65l等发现γ-谷氨酰肽类， 如Glu-y-Gly、Y-Glu-Tyr、Glu-y-Ala 及 Glu-y-Glu 呈酸涩味，后来又发现酸性肽 Gly-Asp、Glu-Leu和 Ala-Glu 等都具有鲜味的特征，因此常常将酸味肽看作鲜味肽的一部分。Okumura等[66]从猪肉中分离得到 APPPPAEVHEVVE ， APPPPAEVHEVV 和APPPPAEVHEVHEEHV3 种酸味肽，且它们可以增强鲜味和咸味。 2.1.5咸味肽 早在1984年， Tada 等167就发一种现咸味二肽 Orn-B-Ala， 其咸味强度与NaCl相当。 Seki 等168进一步研究了 Orn-B-Ala 的理化性质，发现二肽的咸味强度与氨基的解离度以及是否有相对离子有关。一些碱性肽的盐， 如 Orn-TauHCl、Orn-Gly·HCl、Lys-GlyHCl 和 Lys-TauHCl 等具有咸味和鲜味的双重效果。 咸味肽的发现，对高血压、心血管疾病患者等需要低钠饮食的特殊人群有重要的利用价值。Zhul69l等人从无盐酱油中发油 Ile-Phe、Phe-lle 及 Ala-Phe 3种二肽不仅具有咸味，而且 Ile-Phe 和 Ala-Phe 还能抑制血管紧张素转化酶的活性，具有抗高血压的作用。 2.1.6 kokumi 感肽 日本学者将能够引起食品滋味浓厚感与持久感的物质统称为kokumi，这是继umami (鲜味)后产又的又一个创新的食品基本风味描述词汇。近年来，有关食品中“kokumi”成分的研究日益增多，肽的“kokumi”感也作为一种新的呈味特性被人们发现。日本味之素株氏会社研究发现谷胱甘肽具有强烈赋予食品“浓厚感”的功能，并能增强和维持辛辣调味料及蔬菜风味70。Toelstede等[46]研究发现，引起Gouda奶酪浓厚感的主要原因是其成熟过程中蛋白酶和肽酶水解产生的一些含有Glu 的呈味肽组分。Dunkel等171对豆类和奶酪中与"kokumi感相关的呈味肽研究结果表明，能够引起 “kokumi”感的肽类中大部分都含有Glu-Asp 或Glu-Glu 等二肽。此外，含有Cys 的肽段因氨基酸侧链基团上含有的巯基(--SH)，在舌头上能产生一种轻微的收敛感，从而显著增加味觉的浓厚感，所以Cys 残基也对"kokumi"滋味起重要的作用(7。 综上所述，能够引起食品中浓厚感滋味的kokumi 感肽的氨基酸组成特征是可能含有酸性氨基酸Asp、Glu 及含硫氨基酸Cys。 kokumi 感肽可能本身没有呈味功能或者味道很淡，但是在一定条件下，这类肽与适当浓度的其他呈味组分(NaCl、MSG、酸味剂等)能产生协同或者增味之功效1731 2.2肽呈味作用的特点 2.2.1复杂性 食品中存在很多滋味物质，如游离氨基酸、肽、和核苷酸及其代谢产物等，在这些物质中，游离氨基酸、核苷酸及其代谢产物的种类较少、结构固定，能够准确的分析检测，因此对游离氨基酸和核苷酸类滋味物质的研究已相对完善。而肽是由20多种氨基酸排列组合形成的，数目庞大，现有的分析、分离技术很难做到对其一一分离纯化鉴别，因此要准确地评估出每个肽的呈味特性是很困难的， 目前还无法做到。但从部分小肽的呈味特性研究表明，肽在食品中发挥最基本、最传统的呈味作用，不同的肽因肽链长度、氨基酸组成、氨基酸排列顺序不同而呈现出迥异的味感，且甜、苦、酸、咸、鲜五种基本味都能找到相应的呈味肽(74)。 2.2.2综效性 每一种食物都有其独特的味道，而食物口味的呈现是其中各呈味物质之间的综合平衡表现。肽类因含有氨基和羧基两性基团而具有缓冲能力，能赋予食品细腻微妙的风味。呈味肽不仅可直接对滋味产生贡献，还可以与其他呈味物质(如氯化钠、谷氨酸钠、肌苷酸钠、鸟苷酸钠、酸味剂等)产生交互作用，显著提升或改变原有味感，因此通常所说的各种肽的呈味特性是其综合效果，与其作用条件有关。例如， Wang等1601比较了牛肉辛肽(BMP)在不同pH下的感官特性，结果表明BMP在pH在6.5时呈鲜味， pH在9.5时为咸味和甜味，而pH在3.5时为酸味。某些碱性二肽具有很强的咸味，协同构成鲜味，且其味感与氨基的解离度和相对离子的存在有很大关系168]。 2.3肽的分离与鉴定方法 2.3.1呈味肽的分离方法 从复杂的食品体系中提取纯化得到单一的呈味肽，是几代科学家共同努力的方向。如今，色谱技术的发展和应用，为高效分离肽提供了技术保障。首先通过超滤、 凝胶过滤色谱等分离手段，按分子质量大小对肽进行初步分离，再筛选出呈味特性较强的组分，利用高效液相色谱法进一步分离，得到相对单一纯化的肽。 2.3.1.1超滤 超滤(Ultra filtration， UF)是一种利用膜的孔径大小进行筛选分离的过程，即在一定的压力条件下，水溶液流过滤膜表面，小于滤膜孔径的溶剂及小分子溶质透过水膜，形成分离液(滤过液)；比滤膜孔径大的溶质及溶质集团被截留，成为截留液(浓缩液)。超滤是一种快速、有效地获得并浓缩目标分子质量的肽的方法{75]，但其不能得到单一纯化的肽，还需要结合其他分离方法进一步纯化。 呈味肽一般为分子量小于3000 u、氨基酸组成小于10个或10个左右的寡肽，且肽链越长，味感越不明显，因此超滤常作为呈味肽的初步分离手段以去除分子量较大且呈味性弱的肽。Zhang等1761采用截留分子量3000u的超滤河对河豚中提取出的呈味肽做了初步分离； Su等162)采用不同截留分子量的超滤膜对花生粕酶解液进行分离，得到5个组分，分别为PH-I (MW>10 000u)、PH-II(5-10 000u)、PH-III (3-5000u)、PH-IV (1-3 000 u) 和PH-V(MW <1000u)，感官评定结果表明随着分子量的减小，肽组分的滋味强度逐渐增强。 2.3.1.2凝胶过滤色谱 凝胶过滤色谱属于体积排阻色谱 (Size-exclusion chromatography，SEC)， 它是根据分子大小不同而进行分离的。当混合肽溶液通过凝胶柱时，由于凝胶内部含有大量的微孔，只允许相对分子质量较小的肽和缓冲液进入其中，而相对分子质量较大的肽被阻隔在凝胶颗粒外部，在填料间隙中流动，因此比相对分子质量较小的肽更快地被洗脱下来，待分离的组分就能按相对分子质量大小筛分开来。凝胶色谱具有操作方便、设备简单、条件温和、样品回收率高和结果重复性好好优点。 用于呈味肽分离的凝胶过滤柱主要是Sephadex G-25和Sephadex G-15， 其分离的目标分子质量范围分别为1000--5000和100--1500。Su等162采用Sephadex G-25对花生粕酶解液中鲜味最强的超滤分离肽组分进行进一步分离纯化；王娟等7采用Sephadex G-15分别对成熟前期和成熟后期的金华火腿肽提取液进行分离，发现成熟后期肽的组分峰明显增多，与多肽在成熟后期普遍降解为小肽的理论相吻合。 2.3.1.3高效液相色谱 高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography， HPLC) 因其具有高效、高灵敏度、应用广泛、分离速度快等优点，已成为多肽分离领域中重要的分离分析手段。利用高效液相色谱不仅可以在短时间内完成分离的目的，而且还可以完成呈味肽的制备。党亚丽等481利用HPLC从火腿酶解物的凝胶层析组分中进一步分离出两 个组分，并通过改变HPLC条件(增大进样量，提高流速)制备分离的呈味肽组分。 超高效液相色谱 (Ultra Performance Liquid Chromatography， UPLC)是分离科学中的一个新的突破。UPLC 借助于高效液相色法(HPLC)的理论及原理，采用1.7 um颗粒度的填料代替传统的5.0 um颗粒色谱柱填料，从而获得更高的柱效，提高了分析通量和灵敏度，同时缩短了分析时间178]。Han等471采用UPLC，从中国黄酒中分离得到43种生物活性肽及3种呈味肽。 2.3.2呈味肽的鉴定方法 2.3.2.1质谱法 质谱(Mass Spectrometry， MS)具有准确度、灵敏度和自动化程度高等的特点，能准确测量肽的相对分子质量和氨基酸序列，因此在对肽鉴定的研究中占据了重要地位。质谱法的原理是利用电场、磁场将运动的离子(带电荷的原子、分子或分子碎片)按照质荷比不同进行分离检测。近年来，随着质谱技术的发展，质谱分析的每个阶段都有多种方法可供选择。离子源有电喷雾离子化(Electro-spray Ionization，ESI)、基质辅助激光解吸电离 (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization， MALDI) 等；质量分析器有飞行时间(Time of flight， TOF)、离子阱(Iontrap， IT)、四级杆(Quadrupole)、傅里叶变换离子回旋共振 (Fourier transform ion cyclotron resonance，FTICR)及四级杆串联飞行时间(QTOF)等。不同技术的组合在灵敏度、通量、动态范围等方面也有不同的特点，对肽可检测性的检响也不同。Zhang 等176]采用 MALDI-TOF/TOF MS/MS从河豚水提物的分离组分中鉴定出一种具有鲜味和甜味的八肽。王丽娜等17建立了一种快速、高效分析酪蛋白组分氨基酸序列的 LTQ-Orbitrap 质谱方法对乳源酪蛋白的4种主要组分进行分析，结合数据库搜索获得4种组分的氨基酸全序列，结果表明乳牛奶中的4种酪蛋白发生氨基酸替换的部位和比率明显小于山羊奶。 2.3.2.2液质联用技术 HPLC-MS 联用已成为多肽物质快速分离鉴定的有力工具，通过液质联用可实现混合样品中多肽物质自动分离检测。王娟等”对金华火腿中小肽进行分离和鉴定，将小肽提取液通过超滤和凝胶过滤色谱后，采用 LC-MS/MS 纯化鉴定，得到26条主要的小肽。Kang 等180采用 UPLC-Q-TOF MS， 从韩国大酱中分离鉴定出多种对滋味及营养起重要作用的物质，如氨基酸、核苷酸、小肽、和一些有机酸等。 3研究目的和意义 风味是肉品的主要食用品质之一，也是消费者衡量肉制品品质的首要指标。盐水鸭是中国传统肉制品的典型代表，具有皮白肉嫩、肥而不腻、“鲜、香、嫩、滑”的特 点，其鲜香风味是盐水鸭受欢迎的主要原因之一。 目前，国内外对盐水鸭风味的研究主要集中于本课题组：刘源I采用三种萃取技术提取盐水鸭香气，并用气质联用(GC-MS) 进行分析，明确了盐水鸭的主体香味物质，同时研究了传统加工过程中盐水鸭风味前体物质、滋味成分及挥发性风味成分的变化；戴妍82)进一步完善了盐水鸭挥发性风味分析方法，比较了不同二次杀菌的盐水鸭香味、滋味和脂肪氧化情况；复卤是盐水鸭风味形成的关键工艺点，李艳逢[83)分析了盐水鸭老卤中的基本成分、滋味物质及挥发性风味成分，谢伟84)研究了新卤和老卤、复卤后不同工艺对盐水鸭风味的影响，杜垒85在此基础上深入研究了盐水鸭老卤的腌制特性及腌制传质动力学。 综上所述，在盐水鸭风味的研究中，对盐水鸭挥发性风味物质和老卤的研究已趋于完善，但对滋味物质及其呈味评价的研究相对较少；风味前体物质及滋味成分的研究集中于核苷酸类、游离氨基酸、游离脂肪酸、还原糖及硫胺素等，对盐水鸭呈味肽的研究还是空白。因此，本文在前人的基础上，研究了盐水鸭工业化加工过程中滋味物质和味觉特征的变化，以及盐水鸭成品中的呈味肽的分离纯化和鉴定，旨在完善盐水鸭风味研究系统，同时为盐水鸭加工工艺的改进、食用品质的改善和调味品的开发提供理论基础。 ( 参考文献 ) ( [1 ] 周洁， 王 立，周惠明.肉品风味的研究综述[].肉类研究，2003(2)：16-18 ) ( [2]朱国斌，鲁红军.食品风味原理与技术[M]. 北 京：北京大学出版社，1996 ) ( [3] 马 长伟.国 外 肉品风味研究进展[J].肉类研究， 1995(02)： 13-17 ) ( [4] Sasaki K， Motoyama M ， Mi t sumoto M. 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Means with different superscripts in the same row indicatesignificant difference(P<0.05). 2.2盐水鸭加工过程中核苷酸及其降解产物变化分析 2.2.1核苷酸 HPLC 分离条件的优化 由于 5'-GMP 和 5'-IMP 分子结构相似，保留时间接近，因而较难将6种核苷酸标样同时分离。参考李家胜等[14]、邱伟强等'71和李阳杰等{18]的液相色谱条件，先后改变甲醇的比例和磷酸二氢钾缓冲液的 pH对标准品进行分离。试验发现甲醇比例对核苷酸标品的保留时间影响很大，在一定范围内，甲醇比例越高，核苷酸整体保留时间越短；磷酸二氢钾缓冲液的 pH 值对 5'-GMP 和5'-IMP的分离效果有显著影响，多次实验表明 pH5.5的磷酸二氢钾缓冲液能实现六种核苷酸标样较好的分离。最终确定1.2.1所述色谱条件，能在20 min 内将6种核苷酸标样同时分离，分离效果良好(图1-3)。 图1-3核苷酸及其降解产物标准品 HPLC 图谱 Fig. 1-33HPLC chromatogram of standard nucleotides and related compounds 注： 1：5'-GMP， 2： 5'-IMP ， 3：5'-ADP， 4：Hx， 5：5'-AMP， 6：I。 ( N ote： 1 ： 5 '-GMP， 2 ： 5'-IMP， 3 ： 5 '-ADP， 4：Hx，5： 5 '-AMP， 6：I. ) 2.2.2盐水鸭加工过程中核苷酸及其降解产物含量的测定 盐水鸭不同加工过程中核苷酸及其降解产物的干基含量见表1-2。由表1-2可知，盐水鸭中的核苷酸类物质以 5'-IMP和I为主，占总量的 47.33%，，与刘源等研究的鸭肉样品、吴锁连等120)研究的烧鸡样品结果类似。在腌制过程中，5'-IMP、5'-GMP、5'-ADP、5'-AMP的含量均显著下降(P<0.05)，比生鸭肉下降了23.40%-47.78%不等，其原因一方面可能是核苷酸自身的降解，另一方面可能是在复卤时流失到卤水中；而I和 Hx的含量呈上升趋势，可能是 5'-IMP 的大量降解产生。在冷藏过程中， 5'-IMP含量显著下降(P<0.05)，其他核苷酸及其降解产物含量无显著变化。在煮制过程中，5'-IMP、5'-AMP 的含量显著上升(P<0.05)，其可能原因是 5'-ADP 的大量降解，使5'-AMP 含量增加， 5'-AMP又大量降解成5'-IMPI8]；I和 Hx的含量显著下降(P<0.05)。风味核苷酸在煮制前的加工过程中持续下降，煮制后显著上升(P<0.05)，说明煮制工艺是影响风味形成关键工艺点。 表1-2不不同加工阶段盐水鸭核苷酸及其降解产物的含量(干基) Table 1-2 Nucleotide contents in duck meat at different processing stage (Dry matter) 核苷酸 加工阶段 Processing stage Nucleotide 原料鸭 干腌后 复卤后 冷藏后 煮制后 (mg100g) Raw duck End of dry-curing Endof brining End of cold storage End of boiling 5'-IMP 376.94±19.59 222.26±10.14 196.83±10.61° 142.23±12.68° 233.34±18.69° 5'-GMP 59.38±1.06° 49.92±4.08° 45.50±3.89* 50.88±2.59° 39.57±3.71° 5'-ADP 30.37±3.69 24.63±0.80° 22.02±1.32° 23.74±1.50° 18.09±1.31° 5'-AMP 26.85±1.69° 20.51±0.30* 17.55±0.69° 17.91±0.95° 23.47±3.28 I 209.25±17.47° 230.55±12.42 235.03±8.87° 234.38±21.80 174.33±5.48° Hx 78.84±4.82 80.07±7.77ab 83.25±4.50* 92.54±9.80° 76.08±5.38 风味核苷酸² Flavour nucleotides 463.18±19.10° 292.69±6.80° 259.88±13.76° 211.02±10.94° 296.39±12.64° 注：1核苷酸含量 (mean±SD， n=3)；同一行上标不同字母者为差异显著(P<0.05)。 2风味核苷酸为5'-IMP、5'-GMP 和5'-AMP 之和。 Note： 1 Each value is expressed as mean ± SD (n=3). Means with different superscripts in the same row indicatesignificant difference (P <0.05). 2 Flavour nucleotides =5'-IMP+5'-GMP+5'-AMP. 2.3 盐水鸭加工过程中游离氨基酸变化分析 盐水鸭不同加工过程中游离氨基酸的干基含量见表1-3。由表1-3可知，盐水鸭中游离氨基酸含量丰富，必需氨基酸种类齐全。其中鲜味、甜味、苦味氨基酸所占的比例分别为13.10%、30.57%、30.65%。盐水鸭中的主要游离氨基酸为牛磺酸 Tau(212.37mg100"g)、谷氨酸 Glu (96.66 mg100l.g') 和丙氨酸 Ala (95.52 mg100".g)，谷氨酸和丙氨酸是主要的鲜味和甜味氨基酸，可能对盐水鸭的滋味有重要贡献。 游离氨基酸在干腌阶段含量显著下降，复卤阶段含量显著上升，冷藏和煮制阶段含量显著下降(P<0.05)。游离氨基酸的增加和减少取决于其形成与降解量的比率。干腌阶段，鲜味和甜味氨基酸主要呈下降趋势，苦味氨基酸主要呈上升趋势，游离氨基酸总含量下降；复卤阶段绝大多数游离氨基酸含量显著上升(P<0.05)，可能是老卤中的游离氨基酸在高渗透压的作用下转移到鸭肉中；冷藏过程中，游离氨基酸含量下降可能是氨基酸随汁液流失造成的；在煮制过程中，游离氨基酸作为风味前体物质大量参与反应生成挥发性风味化合物从而其含量剧减。复卤和煮制工艺对游离氨基酸的影响最为显著，是影响风味形成的关键工艺点。 表1-3不同加工阶段盐水鸭游离氨基酸的含量(干基)' Table 1-3Free amino acid contents in duck meat at different processing stage (Dry matter) 游离氨基酸² 加工阶段 Processing stage Free amino acid 干腌前 干腌后 复卤后 冷藏后 煮制后 (mg*100g) Raw duck End of dry-curing End of brining End of cold storage End of boiling Glu 238.44±3.22 194.77±5.26° 220.64±12.29” 192.04±11.27° 96.66±4.53° Asp 25.04±2.45° 30.27±3.83 30.15±1.37° 25.13±1.41” 12.28±1.09° ZUAA 263.48±3.10 225.03±6.96° 250.79±13.47° 217.18±9.86° 108.95±5.62° Ser 130.00±4.14 105.07±2.56° 115.40±7.97° 113.06±3.02 53.30±3.13° Ala 224.96±4.55 168.61±5.62° 176.53±6.48° 150.30±0.72° 95.52±2.38° Gly 90.77±2.03 82.19±5.30° 89.20±5.57° 65.90±1.47° 36.91±2.27 Thr 67.17±4.28 72.40±3.90 73.45±4.52 51.48±2.14° 28.19±1.91° Pro 111.83±0.30 88.59±5.70° 96.69±7.47 102.83±4.53° 40.37±1.94° SAA 624.73±8.50 516.85±13.75° 551.28±21.26° 483.57±7.00° 254.29±7.79° Arg 122.81±4.14° 131.78±1.71 133.46±3.23 97.75±3.48° 57.11±1.29° Met 35.31±3.00° 35.32±1.07 41.49±3.57° 30.37±1.59° 13.22±1.27° Ile 44.05±3.90° 44.71±2.62° 55.98±3.50" 34.62±1.65° 17.74±1.21° Leu 88.64±5.47° 89.10±0.47 106.75±3.82° 74.87±2.22° 32.94±2.04 第一章盐水鸭工业化加工过程中滋味物质及味觉特征变化 (续表) Tyr 56.55±3.37° 56.83±3.78° 68.39±4.64 47.75±1.27° 24.99±1.30° Phe 64.77±1.64° 66.29±4.07° 70.48±2.70 56.34±3.38 28.04±2.97° His 22.54±1.97 23.46±1.50° 29.65±3.85 20.78±1.22° 8.49±0.20° Val 64.97±4.76° 62.35±1.17 79.47±3.54 50.12±2.68 22.80±2.01° Trp 20.59±1.80° 21.74±0.79° 27.14±0.38 19.85±1.50° 13.69±0.96° Lys 90.79±4.98° 95.24±3.33° 117.42±3.38 82.86±3.21° 35.92±1.62° YBAA 611.02±28.79° 626.82±16.72° 730.23±26.58° 515.29±6.64° 254.95±12.57° Tau 321.91±5.97 319.21±12.39 278.85±4.53° 239.49±4.39° 212.37±6.57° Om 4.49±0.41 2.60±0.21° 3.08±0.11° 2.47±0.22° 1.20±0.12° XOAA 326.40±6.00° 321.81±12.23 281.93±4.60° 241.96±4.54° 213.57±6.56° XFAA 1825.64±29.66° 1690.52±40.79° 1814.24±40.69° 1458.00±12.42° 831.76±4.14° 注：1游离氨基酸含量(mean±SD， n=3)； 同一行上标不同字母者为差异显著(P<0.05)。 2UAA：鲜味氨基酸， SAA：甜味氨基酸， BAA：苦味氨基酸， OAA： 其他氨基酸， FAA：游离氨基酸。 Note：1 Each value is expressed as mean ±SD (n=3). Means with different superscripts in the same row indicate significant difference (P <0.05). 2 UAA： Umami amino acids， SAA：Sweet amino acids， BAA： Bitter amino acids， OAA：Other amino acids， FAA： Free amino acids. 2.4盐水鸭中滋味物质的呈味作用和鲜味强度评价 滋味物质对滋味的贡献不仅与其含量有关，还与其滋味阈值有关。盐水鸭中呈味5'-苷苷酸和游离氨基酸的含量、滋味特征、阈值[21-22]和滋味活性值见表1-4。由表1-4可知，只有5'-IMP 和Glu 的滋味活性值大于1，对盐水鸭的鲜味有直接贡献。甜味和苦味成分的含量均低于阈值，不直接对滋味产生贡献，但可能与其他物质发生协同作用，间接地增强盐水鸭的风味。已有研究表明，很多氨基酸在含量低于其滋味阈值时也可以增强食品的鲜味和甜味4，所以盐水鸭的最终滋味是多种呈味物质协同作用的结果。 表1-4盐水鸭中滋味物质的含量(湿基)、滋味特征、阈值和滋味活性值 Table 1-4 The contents(Wet matter)， taste attributes， taste thresholds and TAVs of taste compounds in 滋味物质 含量' Content 滋味特征 阈值 Taste threshold 滋味活性值 Taste compound (mg100g) Taste attribute (mg100mL) TAV 5'-IMP 73.32±5.87 鲜味(+) 25 2.93 5'-GMP 12.43±1.17 鲜味(+) 12.5 0.99 5'-AMP 7.38±1.03 甜味(+) 50 0.15 (续表) 54.78±1.72 苦味(一) Nd' Nd Hx 23.91±1.69 苦味(一) Nd Nd Glu 30.38±1.42 鲜味(+) 30 1.01 Asp 3.86±0.34 鲜味(+) 100 0.04 Ser 16.75±0.98 甜味(+) 150 0.11 Ala 30.02±0.75 甜味(+) 60 0.5 Gly 11.60±0.71 甜味(+) 130 0.09 Thr 8.86±0.60 甜味(+) 260 0.03 Pro 12.69±0.61 甜味/苦味(+) 300 0.04 Arg 17.95±0.40 苦味(一) 50 0.36 Met 4.16±0.40 苦味(一) 30 0.14 Ile 5.57±0.38 苦味(一) 90 0.06 Leu 10.35±0.64 苦味(一) 190 0.05 Tyr 7.85±0.41 苦味(一) Nd Nd Phe 8.81±0.93 苦味(一) 90 0.1 His 2.67±0.62 苦味(一) 20 0.13 Val 7.17±0.63 苦味(一) 40 0.18 Trp 4.30±0.30 苦味(一) Nd Nd Lys 11.29±0.51 苦味/甜味(一) 50 0.23 注：1滋味物质的含量 (mean±SD， n=3)。2(+)代表增味，(一)代表减味。3 Nd代表未检测出。 Note： 1 Each value is expressed as mean ± SD (n=3). 2 (+)=pleasant， (一)=unpleasant. 3 Nd means not detected. 盐水鸭在不同加工阶段的EUC见图1-4。由图1-4可知，盐水鸭加工过程中EUC的范围是3.89-7.57 g MSG·100g(湿重)。生鸭肉的EUC最高，因为干腌前呈味核苷酸和鲜味氨基酸的含量均最高；干腌和冷藏过程中，呈味核苷酸和鲜味氨基酸含量均显著下降导致EUC下降；复卤后EUC上升是由于鲜味氨基酸含量的上升；煮制后虽然呈味核苷酸含量显著提高，但是鲜味氨基酸含量显著下降，整体EUC下降。最终盐水鸭成品的EUC为3.89gMSG·100g(湿重)， 即1g盐水鸭鸭肉的鲜味强度相当于0.0389 g MSG所提供的鲜度。MSG的滋味味值是30 mg100mL"， 盐水鸭成品的EUC的TAV值为130，说明盐水鸭有强烈的鲜味强度。 图1-4 不同加工阶段盐水鸭的等鲜浓度 Fig. 1-4Equivalent umami concentration of water boiled salted duck at different processing stage注：n=3；不同字母代表组间差异显著(P<0.05)。 Note： n=3；Different letters indicate significant difference between groups (P<0.05). 2.5盐水鸭加工过程中味觉特征变化分析 采用 TS-5000Z 味觉分析系统(电子舌)测定了不同加工阶段的盐水鸭的味觉特征，分析结果见表1-5。由表1-5可知，同种样品的每种味觉特征值相差不大，说明传感器相应稳定，重现性好。以基准溶液的输出为“0”，但由于基准溶液中含有少量的酸和盐，因此酸味和咸味的无味点分别为-13和-6，因此咸味和酸味会出现一些负值。低于基准溶液输出的项目可以认为该样品没有这种味觉特征，高于该输出的味觉项目作为评价对象。 表1-55不同加工阶段盐水鸭的味味指标数据(mV) Table 1-5 Taste sensor outputs of water boiled salted duck at different processing stage (mV) 加工阶段Processing stage 味觉指标 干腌前 干腌后 复卤后 冷藏后 煮制后 Taste sensor output Raw duck End of dry-curing End of brining End of cold storage End of boiling 咸味 Saltiness -10.19±0.00° 1.27±0.10° 6.00±0.10° 6.49±0.14° 5.55±0.16° 酸味 Sourness -16.81±0.00 -13.44±0.07 -10.57±0.05° -9.90±0.07° -11.51±0.15° 苦味 Bitterness 5.24±0.00° 2.85±0.30° 2.43±0.32° 2.51±0.34° 2.71±0.29 涩味 Astringency 1.57±0.00° 0.65±0.03° 0.30±0.02° 0.47±0.03° 0.21±0.06° 鲜味Umami 9.07±0.00 7.82±0.04° 6.86±0.15° 6.63±0.16° 7.24±0.16° 丰富度 Richness 3.24±0.00" 3.16±0.43 3.27±0.33° 3.91±0.32° 4.78±0.06° 涩味回味 Aaftertaste-A -0.23±0.00” -0.19±0.03 -0.13±0.04° -0.13±0.04° -0.14±0.02bc 苦味回味 Aaftertaste-B -0.64±0.00° -0.43±0.03° -0.26+0.03 -0.21±0.03 -0.23±0.00d 注：数值表示为 mean±SD， n=3；同一行上标不同字母者为差异显著(P<0.05)， Note： Each value is expressed as mean ± SD (n=3). Means with different superscripts in the same row indicatesignificant difference (P<0.05) 2.5.1盐水鸭不同加工阶段的味觉分布雷达图 雷达图可以清晰、客观、整体地反映各个样品之间的味觉差异，盐水鸭不同加工过程阶段的味觉分布雷达图见图1-5。其中横坐标上的单位表示味觉的单位，一个单位代表样品之间浓度相差了20%。韦伯定律指出231，20%的浓度是人舌能够识别到的最小差异，如果差异小于一个单位，那么正常人就不能感觉出样品之间的差异。由图1-5可知，盐水鸭加工过程中咸味变化最显著，酸味、苦味、涩味、鲜味和丰富度的变化相对较小，涩味回味和苦味回味几乎为0。因此选择以下味觉指标作为评价项目详细分析：咸味、酸味、苦味、涩味、鲜味和丰富度。 图1-5不同加工阶段的盐水鸭味觉雷达图 Fig.1-511A cobweb diagram depicting the taste sensor outputs (mV) of water boiled salted duck at different processing stage 结合表1-5和图1-6可知，盐水鸭加工过程中咸味变化最显著：原料鸭几乎没有咸味，在干腌、复卤和冷藏过程中咸味显著升高(P<0.05)，煮制后咸味又显著下降(P≤0.05)。鲜味和丰富性变化相对较小：原料鸭的鲜味最强，在干腌、复卤和冷藏过程中均显著下降(P<0.05)，煮制后鲜味又显著上升(P<0.05)：原料鸭的丰富度(鲜味回 味)在干腌、复卤阶段无显著性变化，冷藏和煮制阶段显著上升(P<0.05)， 煮制后达最大值。 图1-6 鲜味、咸味和丰富度的味觉雷达图 Fig.1-66 A cobweb diagram depicting the taste sensor outputs(mV) of umami， saltiness and richness 结合表1-5和图1-7可知，盐水鸭加工过程中，酸味、苦味和涩味这些不良滋味呈下降趋势。原料鸭的苦味和涩味最强，酸味最弱；在干腌、复卤过程中，苦涩味明显减弱，酸味略微增强；冷藏过程中，酸味和苦涩味均略有回升；煮制后盐水鸭成品的酸味和苦涩味均处于较低水平。 图1-7酸味、苦味和涩味的味觉雷达图 Fig.1-71A cobweb diagram depicting the taste sensor outputs (mV) of sourness， bitterness and astringency 2.5.2盐水鸭不同加工阶段的主成分分析结果 主成分分析(Principal component analysis， PCA) 是一种多变量分析技术，是考 察多个变量间相关性的一种多元统计方法，通过少数几个主成分来揭示多个变量间的内部结构。味觉数据的主成分分析是将所提取的传感器多指标的信息进行数据转换和降维，并对降维后的特征向量进行线性分类，最后在 PCA 图上显示主要的二维图。PC1 和 PC2 表示在 PCA转换中得到的第一主成分和第二主成分的贡献率，贡献率越大说明主成分可以越好地反映原始多指标的信息[24]。主成分分析图中，样品间的距离越大说明味觉差异越明显，距离越小说明味觉越接近。 图1-8为不同加工阶段盐水鸭的味觉主成分分析图，横坐标代表主成分PC1，纵坐标代表主成分PC2， 两者的累积贡献率达99.21%，，1可以代表原始数据的全部信息。由图2-6可知，电子舌可以有效区分不同加工阶段盐水鸭的味感差异，其中原料鸭、干腌后鸭肉与其他样品味觉差异较大，复卤后三个阶段的盐水鸭样品的味觉特征在第一主成分上几乎无差异，仅在第二主成分上有少许差异。 Fig.1-8 图1-8 不同加工阶段盐水鸭的味觉主成分分析图Principal components analysis for the taste of water boiled salted duck at different processing stage 2.6盐水鸭味觉特征与滋味物质的相关性 相关性分析是对样本中变量间的线性关系的密切程度进行分析。Pearson 相关系数是常用的用来反映两个变量线性相关程度的统计量。相关系数的值越高，则则量间的关联程度也越大(25)。 对盐水鸭加工过程中6种味觉特征和8类滋味物质的变化趋势进行 Pearson 相关性分析，结果如表1-6所示。由表1-6可知，咸味的变化与 NaCl 含量显著正相关(P <0.05)，与风味核苷酸含量显著负相关(P<0.05)；酸味的变化与 NaCl 含量极显著正相关(P<0.01)，与风味核苷酸含量显著负相关(P<0.05)；苦味的变化与风味核苷酸含量量显著正相关(P<0.01)；涩味的变化与等鲜浓度显著正相关(P<0.05)；鲜味的变化与与 NaCl 含量显著负相关(P<0.05)，与风味核苷酸含量极显著正相关(P<0.01)；丰富度与鲜味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸含量均显著负相关(P<0.05)。 表 1-6 盐水鸭味觉特征与滋味物质的 Pearson 相关系数 Table 1-6 Pearson correlation coefficients between taste attributes and taste compounds of waterboiled salted duck 咸味 酸味 苦味 涩味 鲜味 丰富度 Saltiness Soumess Bitterness Astringency Umami Richness NaCl .947* .965** NS NS -.959* NS pH NS NS NS NS NS NS 风味核苷酸 Flavour nucleotides 苦味核苷酸 -.948* -.956* .959** NS .965** NS Bitter nucleotides NS NS NS NS NS NS 鲜味氨基酸 ZUAA NS NS NS NS NS -.935* 甜味氨基酸 SAA NS NS NS NS NS -.934* 苦味氨基酸 XBAA NS NS NS NS NS -.952* 等鲜浓度 EUC NS NS NS .901* NS NS 注：**表示相关性极显著(P<0.01)；*表示相关性显著(P<0.05)； NS 表示相关性未达到显著水平。Note： **. Correlation is significant at the 0.01 level； *. Correlation is significant at the 0.05 level； NSmeans not significant. 3讨论 3.1盐水鸭加工过程中基本成分的变化规律 盐水鸭在工业化加工过程中水分含量持续下降，这一结果与采用传统工艺生产的盐水鸭和卤鸭[26品样品类似。加工过程中由于水分的流失使蛋白质含量增加，特别是煮制阶段水分含量显著下降引起蛋白质含量的显著升高27。刘源等[8]和赵双娟等[26]采用传统工艺生产盐水鸭和卤鸭时均发现，鸭肉中 NaCl 含量在干腌后显著上升，复卤(湿腌)后显著下降；但在工业化生产过程中， NaCl 含量在干腌、复卤和冷藏过程中均呈显著上升趋势，其中复卤过程上升幅度最大，这种差异可能与腌制剂用量、老卤成分、卤制时间有关。工业化生产的盐水鸭成品中 NaCl 含量比传统工艺略低8，为3.10%，但远高于咸味的阈值100mM， 因此 NaCl 对盐水鸭的咸味有直接的贡献。 盐水鸭的 pH值在加工过程中处于变化不明显的弱酸范围(5.66-6.01)，此时谷氨酸以鲜味最强的谷氨酸一钠形式存在27，可能对盐水鸭的鲜味有影响。 3.2盐水鸭加工过程中核苷酸及其降解产物的变化规律 核苷酸及其降解产物的含量变化是一个相对复杂的动态过程，腺苷二磷酸(ADP)脱去一个磷酸基团生成腺苷酸(AMP)， AMP 脱去一个氨基生成肌苷酸(IMP)，而 IMP最终又降解成肌苷(Ⅰ)和次黄嘌呤(Hx)[28]。腌制过程中，5'-ADP、5'-AMP、5'-IMP的含量下降，Ⅰ和Hx的含量上升， 与 ADP 的降解过程相符。与复卤相比，，干腌对核苷酸含量变化的影响更为显著，说明核苷酸的降解途径主要发生在干腌过程中。 传统盐水鸭生产过程中，复卤后采用的是烘烤工艺，而工业化生产复卤后采用的是冷藏低温陈化工艺。Liu 等研究的盐水鸭经过传统烘烤工艺以后， 5'-IMP、5'-GMP和5'-AMP这三种风味核苷酸含量均显著下降，而在工业化冷藏工艺中，仅 5'-IMP的含量显著下降， 5'-GMP 和 5'-AMP的含量有小幅度的上升，说明冷藏低温陈化工艺对风味核苷酸的影响较小。 核苷酸中鲜味物质(5'-IMP， 5'-AMP) 在煮制后含量增加，苦味物质(I， Hx)含量减少，这与 Dai 等的研究结果相似。盐水鸭成品中风味核苷酸的值达 296.39mg100°g(干重)，高于烧鸡[201与卤鸭样品I26]，甚至可以与茶树菇和牛肝菌等蘑菇类媲美[6.29]，是盐水鸭滋味鲜美的重要原因之一。 3.3盐水鸭加工过程中游离氨基酸的变化规律 大部分游离氨基酸在干腌阶段含量显著下降，复卤阶段含量显著上升，冷藏和煮制阶段含量显著下降。与 Liu 等研究的结果不同，在传统生产工艺下，干腌对游离氨基酸影响不明显，复卤烘烤后游离氨基酸含量上升，煮制后又急剧下降。游离氨基酸变化规律的差异性，主要在于加工工艺及其工工参数的差异，包括腌制剂使用量，腌制时间和加工温度等126]。 呈味功能相同的游离氨基酸在不同加工过程中变化规律大体相同，甜味氨基酸干腌后含量下降，复卤后含量上升，冷藏后含量持续下降；苦味氨基酸在冷藏前持续上升，冷藏后持续下降。这可能与他们化学结构的差异有关，甜味氨基酸通常带有一定亲水性的助味基，苦味氨基酸通常带有疏水性侧链301，呈味氨基酸的含量变化与化学结构之间的关系还有待进一步研究。 煮制后的盐水鸭成品中游离氨基酸总量为831.76mg100g(干重)， 以Glu和Ala为代表的呈味氨基酸总量为618.19 mg100g(干重)，高于卤鸭[26]与南京板鸭1311样品，是盐水鸭滋味鲜美的重要原因之一。 3.4盐水鸭中滋味物质的呈味作用和鲜味强度评价 动物性食物中含有大量 5'-IMP，是肉类鲜味的主要来源之一；而5'-GMP 主要存在于植物性食品中，如蘑菇类，但对肉类鲜味的贡献也十分显著。5'-IMP、5'-GMP与谷氨酸钠同时存在时，鲜味协同增强[32-33]，这是由于5-核苷酸存在时，鲜味的受体蛋白质与核苷酸结合产生变构，从而更易与 MSG 结合[33]。5-AMP的呈味特征与浓度有关， 当5'-AMP含量为 50-100 mg100mL"时，只有甜味无鲜味，但是当少量5'-IMP存在吋，鲜味和复合滋味便可呈现，同时甜味也会增强，这主要是因为5'-AMP和5'-IMP间有相互协同作用(34]。然而，5-IMP的降解产物次黄嘌呤和肌苷会产生苦味[8-9]。 游离氨基酸通常具有酸味、甜味和苦味等。谷氨酸 (Glu) 和天冬氨酸(Asp)本身具有酸味，但当食品中有钠盐存着时，它们可以提供强烈的鲜味，是最主要的鲜味氨基酸32。谷氨酸(Glu)不仅具有鲜味，还能提高风味的醇厚、柔和等特征【33]。甘氨酸(Gly) 和丙氨酸(Ala) 具有令人愉悦的甜味，在海产品中含量丰富，是主要的甜味氨基酸。丙氨酸(Ala)不仅具有甜味，与谷氨酸、鸟苷酸、肌苷酸等鲜味物质配合能发挥鲜味相乘作用，还可引出肉类、鱼类、果实类、海藻类、食用菌等的鲜味成分[33)。甜味氨基酸和核苷酸之间也存在协同作用，当有肌苷酸存着时甜度显著增加[35]。带疏水侧链的游离氨基酸通常有苦味，但苦味氨基酸不一定对滋味产生不良影响，目前已有研究发现带有苦味的苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)也具有提鲜作用，是酱油中重要的呈味氨基酸36]，在水产品中，苦味的精氨酸(Arg) 被其他成分掩盖从而引起了风味的增强1331. 盐水鸭成品中只有5'-IMP 和Glu 的滋味活性值大于1，对盐水鸭的鲜味有直接贡献，与Dai等的研究结果相似；其他核苷酸和游离氨基酸的含量均低于阈值，但可能与其他物质发生上述协同作用[32-36]，间接地增强盐水鸭的风味。盐水鸭成品的EUC为3.89g MSG100g(湿重)，接近中国大闸蟹(4.2gMSG100lg， 湿重)4，高于牡蛎、文蛤和波纹巴非蛤(3.2、1.9、2.7 gMSG100.g，湿重)等贝类，说明盐水鸭有强烈的鲜味强度。 3.5盐水鸭加工过程中的味觉变化及其与滋味物质的相关性 滋味物质之间可以相互作用，增强或减弱五种基本味觉的强度，这就是所谓的协同/抑制效应。在滋味研究中，即使食品中所有的滋味物质均被定量分析出来，也不能准确反应样品的实际味道，因此采用感官评定或人工智能味觉分析系统(电子舌)十分必要。 TS-5000Z 电子舌系统的味觉传感器是由人工脂质膜(类似人舌)构成，输出数据与人类感官评分有极高的相关性37-38]，能够客观、真实地反应样品的味觉特征。此 外， TS-5000Z 还拥有独特的回味测量技术，目前已经广泛地应用到茶、酒、牛奶、豆瓣酱、酱油等食物中38]，但在肉制品中的应用还鲜有报道。采用 TS-5000Z 对盐水鸭的味觉测量表明，在盐水鸭加工过程中，咸味变化最显著，是采用大量炒盐盐腌和高浓度的老卤复卤的结果；煮制是盐水鸭鲜味增强的关键工艺点，鲜味和丰富度在煮制后均显著增强，可能原因是 5'-IMP， 5'-AMP 等鲜味物质含量的积累；酸味、苦味和涩味等不良滋味在加工过程中呈下降趋势，可能原因是I， Hx 和苦味氨基酸等苦味物质含量下降。 对味觉与滋味物质的相关性分析表明，盐水鸭中的 NaCl 和风味核苷酸均与多种味觉变化有相关性，进一步说明了滋味物质呈味作用的综效性。盐水鸭在加工过程中咸味与 NaCl 含量呈显著正相关；鲜味与风味核苷酸含量呈极显著正相关，与鲜味氨基酸含量不相关，说明盐水鸭的鲜味与风味核苷酸的关联程度最高。鲜味与等鲜浓度相关性不显著，说明等鲜浓度并不能全面地评价盐水鸭的鲜味，除了风味核苷酸和鲜味氨基酸以外，其他的鲜味物质(如呈味肽等)也可能对盐水鸭的鲜味有影响。酸味和pH 相关性不显著，说明食品的酸味味觉特征和pH计测出的酸度还是有区别的。 4结论 盐水鸭工业化加工过程中水分含量呈下降趋势，蛋白质含量在煮制前加工过程中变化不大，煮制后显著增加。盐水鸭的 NaCl 含量和较低的 pH值，对其咸味和鲜味的感官特性影响较大。 风味核苷酸(5'-IMP、5'-GMP、5'-AMP)在盐水鸭煮制前的加工过程中含量持续降低，煮制后含量显著升高，I和Hx的变化规律与其相反；大部分游离氨基酸在干腌阶段含量下降，复卤阶段含量上升，冷藏和煮制阶段含量显著下降。复卤和煮制工艺对滋味物质的变化影响最为显著，是盐水鸭加工的关键工艺点。 盐水鸭成品中的核苷酸类物质以5'-IMP 和Ⅰ为主，主要游离氨基酸为 Tau、Glu和Ala。 5'-IMP 和 Glu 的 TAV 值大于1，对盐水鸭的滋味有直接的贡献，盐水鸭的EUC 值为 3.89gMSG·100g，说明盐水鸭有强烈的鲜味。 在味觉特征方面，盐水鸭加工过程中咸味变化最显著；鲜味和丰富度均在煮制后显著上升。酸味、苦味和涩味这些不良滋味在加工过程中呈下降趋势，在盐水鸭成品中均处于较低水平。滋味物质的呈味作用具有综效性，盐水鸭的味觉特征与多种滋味物质显著相关。 ( 参考文献 ) ( [1 ] 邱洪冰，郭宝燕.盐水鸭的加工工艺[J].肉类工业，200 7 ，27(1)： 6-7 ) ( [2]戚军，殷露琴，卢义伯.盐水鸭生产中关键工艺点及改进的研究进展[J].肉类工业，2010，30(5)： 47-51 ) ( [3 ] 王玉涛，王世锋，刘孟州 ， 等.应用HS-SPME和GC/MS技术检测舍饲合作猪肌肉中的风味物质 [J].核农学报，2008，22(5)：654-660 ) ( [4] Chen D W. 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Sensors， 2010，10(4)：3411-3443 ) 第二章盐水鸭中呈味肽的分离纯化及结构鉴定 风味是评价食品食用品质的重要指标之一，包括气味和滋味。氨基酸、小分子肽、核苷酸代谢产物及无机盐等均对滋味具有重要的贡献作用。20世纪60年代，肽的滋味特性开始引起国内外学者的关注，陆续从奶酪、酒、火腿等多种食物中分离鉴定得到呈酸、甜、苦、咸、鲜5种基本味的呈味肽。呈味肽是指从食物中提取或者由氨基酸合成的对食品风味具有一定贡献的小分子肽。它不仅包括本身呈现一定滋味特征的肽，还包括补充或增强食品原有风味的增强肽，因此通常所说的各种肽的呈味作用是指其综合效果。 呈味肽对加工肉制品的滋味有不可取代的重要贡献。Yamasaki 等在1978年首次从木瓜蛋白酶处理的牛肉中分离出了具有“鲜美”味道的牛肉八肽；党亚丽等分离鉴定出与巴马火腿酶解物味觉特性相似的呈味肽；张梅秀等从河豚鱼汤中分离出一种具有甜味和鲜味的八肽。盐水鸭是中国传统肉制品的典型代表，至今已有一千多年历史，具有皮白肉嫩、肥而不腻、“鲜、香、嫩、滑”等特点，深受国内外消费者喜爱。Liu 等(8)和 Dai 等人已经对盐水鸭中的滋味物质做了比较系统地研究，并测定了核苷酸代谢产物、游离氨基酸、无机盐、还原糖等物质的含量，但对小肽的研究还局限于用反相液相色谱定量分析，对盐水鸭中呈味肽分离鉴定方面的研究还未见报道。 本章采用分级超滤、葡聚糖凝胶过滤层析等一系列方法对盐水鸭中的呈味肽进行分离纯化，结合感官评定、电子舌和液质联用技术对呈味肽组分进行筛选和鉴定，采用多肽固相合成方法合成三个目标呈味肽，并对其进行呈味特性研究，以期对盐水鸭滋味研究系统进行完善，同时为盐水鸭的加工利用和调味品开发提供理论基础。 1材料与方法 1.1实验材料 1.1.1原料 盐水鸭为南京某公司生产，取鸭胸肉去脂肪去筋膜，真空包装于-20℃下保藏备用。 1.1.2主要试剂 葡聚糖凝胶 Sephadex G-15GE公司甲酸色谱纯Sigma 公司乙腈色谱纯Spectrum Chemical Mfg Corp氯化钠分析纯国药集团化学试剂有限公司 谷氨酸钠分析纯国药集团化学试剂有限公司柠檬酸分析纯国药集团化学试剂有限公司蔗糖分析纯国药集团化学试剂有限公司 1.1.3主要仪器 IKA-Utlea-turrax T-25 匀浆器 德国 Braun公司RO-NF-UF-4050型膜分离装置 上海摩速科学器材有限公司膜组件(截留分子量分别为3000和200) 上海摩速科学器材有限公司蛋白纯化层析系统和组份收集器 美国GE公司UNICHROMAT 1500型层析冷柜 德国UniEquip 公司ALPHA 2-4 LSC型真空冷冻干燥机 德国 Christ 公司ASTREE 电子舌 法国 Alpha. MOS 公司Nano RSLC 液相系统 美国Thermo 公司LTQOrbitrap XL 质谱仪 美国 Thermo 公司7150型超纯水机 美国 Thermo 公司AG64R型离心机 美国 Beckman公司AUY120型电子天平 日本 Shimadzu 公司 1.2实验方去 1.2.1盐水鸭中呈味肽的提取 参考 Salles 等0]和党亚丽等]的方法，采用温水法提取呈味肽，并略有改动。具体方法如下：取250g左右肉样切碎，加入800 mL 超纯水用高速分散器均质(10000r*min， 3×30s)， 40℃水浴搅拌1h， 离心 (4℃， 12 000 r*min， 20 min) 后取上清液，沉淀物加200 mL超纯水按上述步骤重复提取1次，合并2次上清液。 1.2.2呈味肽提取液的分级超滤浓缩 将1.3.1制备的盐水鸭呈味肽提取液经聚丙烯滤膜(50mm)过滤后，用相对分子质量截留3000的超滤膜在25℃，0.4 MPa的条件下进行超滤，收集通过超滤膜的滤过液组分。滤过液在相同条件件通过相对分子质量截留 200的纳滤膜，收集纳滤膜截留的浓缩液组分。将上述步骤得到的相对分子质量在200~3000之间的呈味肽浓缩液冷冻干燥，-20℃保藏备用。 1.2.3呈味肽的凝胶层斤柱分离 将1.3.2制备的呈味肽浓缩液冻干粉用超纯水溶解，经0.45 um 的水相滤膜过滤，再用 Sephadex G-15凝胶层析柱进行分离。分离条件：玻璃层丑柱(1.6cmx60 cm)， 洗脱液为超纯水，上样量2mL， 流速1mL.min°， 检测波长214 nm， 灵敏度1.0。分别对每个分离峰组分进行收集，冷冻干燥后备用。 1.2.4凝胶分离分分的感官评定 感官评定小组由4名男性和4名女性专业评价人员组成。评定前，对他们进行5种基本味即甜味、咸味、苦味、酸味和鲜味的感官适应性培训。感官评定在温度为(23±2)℃的感官评价室进行。 采用滋味稀释分析 (Taste dilution analysis， TDA)法：按照Frank 等2的方法略有改动，分别取呈味肽超滤浓缩液和凝胶分离组分的组干粉配成 10 mgmL"溶液，按体积比 1：1 的比例用超纯水进行逐步稀释。取各组分逐步稀释的样品溶液每次5 mL，按照浓度降低的顺序呈送给8位感官评定员，每个稀释水平溶液采用三点差别试验(附录)进行评定。当某个稀释水平的溶液与空白(水)之间的滋味差异刚好能被识别出来，记录此时的稀释倍数，即稀释值(TD)。 TD 值为各评定员感官结果的平均值，评定结果之间的误差应低于或等于一个稀释水平。此外，感官评定时，每个评定员须描述每次呈给样品的滋味特性。 1.2.5凝胶分离组分的电子舌分析 本试验中采用的是法国 Alpha. MOS 公司的 Astree 电子舌系统(图2-1)。该电子舌系统包含一个参比电极、7根非专一性化学传感器传列(ZZ、BB、GA、CA、HA、JB和JE)、模式识别系统及电信号处理器。每根传感器阵列具有不同的有机硅胶膜，分别对酸、甜、苦、咸与鲜这5种基本味觉都有不同程度的敏感性。传感器阵列可以对不同的滋味分子产生非特异性吸附，电信号处理器将传感器与参比电极间的电势差变化转化为可描述的电信号数据，再通过数据处理软件将电信号数据转化成可以解释的数据模型。数据采集前，电子舌需要通过稳定、校准和诊断等步骤，以保证数据的可靠性和稳定性。 将呈味肽超滤滤缩组分、凝胶分离组分的冻干样品分别用超纯水配成0.5 mgmL"的溶液各80mL。同时配置6 mM NaCl、6 mM NaCl-MSG、20mM蔗糖溶液和5mM柠檬酸各80mL，分别作为咸味、鲜味、甜味和酸味的参照溶液。在感官评定的结果中并没有出现苦味，因此没有配置苦味的参照溶液。样品在室温下进行测定，每个样品数据采集时间为120s， 每1s采集一个数据，选取第120秒上的响应值作为原始数据信 号进行处理。电子舌传感器每测一个样品清洗一次。每个样品3个平行，每个平行重复测7次，取最后3次重复测定数据的平均值进行主成分分析。 图2-1 电子舌系统13] Fig.2-1 The Astree electronic tongue system 1.2.6LC-MS/MS分离鉴定 结合感官评定和电子舌分析结果，筛选出滋味特性最强的凝胶分离组分。将此凝胶分离组分的冻干粉配成 10 mg*mL'的溶液，用 Nano-LC-ESI LTQ-Orbitrap MS/MS液质联用仪分离鉴定。 液相条件：色谱柱为 Acclaim PepMap 100 C18 (3 pum， 15 cmx75 um， 100 A)；流动相A： 0.1%甲酸溶液，流动相 B：80%乙腈溶液(含0.1%甲酸)，梯度洗脱：0~5min(2% B)， 5~40 min (2%~35% B)， 40~45 min (35%~95%B)，45~54 min (95%B)，54~55 min (95%~2% B)， 55~60 min (2%B)； 流速为 300 nLmin；进样体10 uL。 质谱条件：采用纳升电喷雾离子源，电离模式： ESI(+)，喷雾电压为2.2kV，毛细管温度为200℃。一级质谱在 Orbitrap 里扫描，扫描范围是350~1800mz'，分辨率为60000；二级质谱采用动态数据依赖性扫描(data dependent scan， DDS)， Orbitrap分辨率设为7500，碰撞能量设为40%，活化q值为0.25，活化时间为 30 ms。选取 5个上一级的最高峰进行高能碰撞诱导解离(HCD)碎片扫描，所得信息用 PEAKS 软件进行 De Novo 测序，并将测得序列搜寻脊椎动物库得到最合适的鉴定结果。 1.2.7呈味肽的合成 采用多肽固相合成法于上海强强生物科技有限公司合成目标呈味肽，纯度为98%以上。 2结果与分析 2.1凝胶层析分离条件的选择 凝胶色谱的分离效果受上样量、洗脱液的离子强度及 pH 值、洗脱流速等因素的影响。呈味肽的凝胶层析分离需要满足两个条件：首先要要保每个组分尽量分开，分离度越高越好；其次为了满足后续大量收集分析的要求，进样量越大越好，分离时间越短越好。由于分离得到的呈味肽后期要进行滋味的感官评定，因此采用超纯水作为洗脱液。 本试验比较了3种凝胶分离条件，分别为进样量3 mL 和流速1 mLmin， 进样量2 mL 和流速 1 mLmin， 进样量2 mL 和流速0.75 mLmin。由图 2-2-a~c可知，这3种条件下均出现5个分离峰，进样量对峰的分离度影响较大，进样量越小，凝胶层析分辨率越高；流速对峰型的影响较大，对分离度影响不大。综合考虑后选用进样量2mL和流速1mLmin的分离条件，分离效果较好，且进样量适中、耗时较短能满足后期大量制备的要求。将凝胶层析分离出的组分分别命名为 F1、F2、F3、F4和F5。 图2-2 不同条件下盐水鸭超滤组分的凝胶层析色谱图 Fig.2-2 (Gel filtration chromatograms of ultrafiltration fractions obtained from water boiled salted duck a. 进样量3mL， 流速1 mLmin' Injection volume： 3 mL， flow rate：1 mLmin'； b. 进样量2 mL， 流速1mL.minInjection volume：2 mL， flow rate： 1 mLmin； c. 进样量2mL， 流速0.75 mLminInjection volume： 2 mL， flow rate：0.75mL·min. 2.2凝胶分离组分的感官评定 对盐水鸭的超滤分离组分F和凝胶分离组分F1-F5 进行感官评定(表2-1)。由表2-1可知，超滤分离组分F和凝胶层析分离组分F1滋味特性最强，稀释因子达128，其他分离组分 F3、F4、F5和F6的稀释因子分别为64、64、32和32。分离组分F1的感官属性与Ｆ最为接近，以鲜味为主，并伴有咸味、甜味和浓厚感。 表2-1 盐水鸭超滤组分和凝胶分离组分的感官评定结果 Table 2-1 Sensory evaluation of six peptide fractions of water boiled salted duck separated byultrafiltration and gel filtration chromatography 组分 稀释因子 感官属性 Fraction Taste dilution factor Sensory attributes 鲜味突出、甜味、咸味、浓厚感、肉味 F 128 Strong taste of umami， sweetness， saltness， kokumi， meat taste 鲜味突出、咸味、甜味、浓厚感 F1 128 Strong taste of umami，saltness，sweetness， kokumi F2 64 咸味、鲜味、甜味、涩味 Saltness， umami， sweetness， astrigency F3 64 咸味、鲜味、甜味、涩味 Saltness， umami， sweetness， astrigency F4 32 咸味减弱，甜味 Weak taste of saltness， sweetness F5 32 甜味、少许酸味 Sweetness， a little sourness 2.3 凝胶分离组分的电子舌分析 图2-3为电子舌对六个分离组分(F、F1、F2、F3、F4和F5)分析结果的PCA图。众所周知，味精(MSG)能增强食品的鲜味和口感，但是单独的MSG溶液口感不佳， 所以本实验中选用NaCl-MSG混合溶液作为鲜味的参考溶液。电子舌分析基于电极的感测材料层与样品发生化学反应产生电信号，张爱霞5的研究表明，电子舌对NaCl、MSG和柠檬酸等在溶液中电离程度大的物质检测灵敏度较高，而蔗糖属于非电电质，电子舌对其检测灵敏度较低，因此本实验中根据不同的检测灵敏度配置不同浓度的参考溶液。 由图2-3可知， PCA图中二维主成分的累积贡献率达到98%，其数据可以代表原始数据的全部信息。相同样品的散点图聚集在一起，每个分离组分之间独立分开，表明不同组分的滋味具有差异性，间隔越远，滋味差异越大。与参照溶液比较， F1、F2和F3均离NaCl-MSG溶液最近，表示其滋味特性最接近鲜味，其次是咸味，甜味和酸味较弱。F4和F5离蔗糖溶液距离最近，表示其滋味特征最接近甜味，鲜味、咸味和酸味都较弱，这与感官评定结果类似。电子舌的分析结果表明， F1、F2和F3组分的滋味差异不大，且都接近组分F。呈味组分的筛选多以感官评定为主，电子舌分析为辅，因此结合感官评定和电子子的分析结果，选取TD值最大且感官滋味最接近F的F1组分进行下一步分离鉴定。 图2-3盐水鸭超滤组分和凝胶分离组分的电子舌主成分分析图 Fig. 2-3 Principal components analysis for six peptide fractions of water boiled salted duck separatedby ultrafiltration and gel filtration chromatography 2.4凝胶分离组分的 LC-MS/MS 分离鉴定 结合感官评定和电子舌的分析结果，选取凝胶分离组分F1进行LC-LTQ OrbitrapXL MS分离鉴定，得到样品的基峰离子流色谱图(图2-4). 图2-4盐水鸭凝胶分离组分F1的基峰离子流色谱图 Fig.2-4 Base peak ion chromatography of F1 peptide fraction of water boiled salted duck separated bygel filtration chromatography 在质谱分析过程中，精确质量数扫描可以确定离子所带电荷数，利用二级质谱得到的碎片离子可识别肽段的氨基酸序列。目前利用质谱数据鉴定蛋白质和肽序列的常用分析方法是从头测序和数据库搜索。肽链经过二级质谱轰击，裂解后主要形成三种离子：序列离子、中间碎片离子和卫星离子。在序列离子和中间碎片离子中都存在b和y离子。同时，，：二级质谱中出现b和y系列离子的机率较大，因为肽链中酰氨键更容易断裂。同一系列内相邻2个离子的质荷比差值含有它们之间相差的氨基酸信息，因此，可根据二级质谱数据中的b和y离子碎片，采用从头测序鉴定多肽的氨基酸序列[16] 通过De Novo软件从头测序和数据库搜索匹配后鉴定出7条肽链，如表2-2所示。其中可信度 (Average local confidence， ALC)， 是每个氨基酸在肽链中的测序准确率(0~100%)的平均值。当肽链中有单个氨基酸碎片离子(如L和I，K和Q)有相同或相似的相对分子质量，或者2个氨基酸碎片离子的相对分子质量之和相同或相似(如Q128或 K 128=G57+A 71； W 186=S 87 +V 99/G57+E 128； N 114=G 57+G57；R 156=G 57+V99； A 71+S 87=G 57+T111)时，都会影响测序结果中氨基酸序列的可信度。在本试验中，将可信度在75%~100%之间的测序结果默认为可信的。 表2-2 盐水鸭凝胶分离组分F1中鉴定的特征肽段 Table 2-2 Specific peptide sequences identified in F1 peptide fraction of water boiled salted duckseparated by gel filtration chromatography 肽 保留时间 质合比 相对分子质量 可信度 肽段序列 离子响应强度 Peptide Retention time mz Molecular weight ALC(%) Peptide sequence Signal strength of peptide ions F1-1 19.29 370.2384 738.4639 70 KPLATLP 3.15E+06 F1-2 26.74 457.7594 913.5055 73 TMRVVPVP 1.16E+07 F1-3 27.46 528.2841 1 054.5559 92 VVTNPSRPW 6.81E+06 F1-4 28.54 453.7261 869.4395 88 RPPWVTD 7.19E+04 F1-5 28.61 397.6963 793.3792 93 DPLRYM 5.71E+07 F1-6 30.80 446.222 4 890.4320 86 PDPLRYM 6.39E+06 F1-7 31.46 474.7331 947.4534 85 GPDPLRYM 9.71E+07 由表2-2可知，组分F1中均为氨基酸组成个数6~9个的寡肽，大部分肽的相对分子质量在1000左右， 与王蓓'7、Su Gl8]等人的呈味肽分离鉴定结果相似。其中， F1T3、F1T5和F1T7的离子响虽强度较高，且测序可信度高，分别为92%，93%和85%，因此初步判断Gly-Pro-Asp-Pro-Leu-Arg-Tyr-Met(GPDPLRYM)、Asp-Pro-Leu-Arg-Tyr-Met(DPLRYM) 和Val-Val-Thr-Asn-Pro-Ser-Arg-Pro-Trp (VVTNPSRPW) 这三条肽为主要呈味肽，它们的一级质谱图和二级质谱图见图2-5。 图2-533种主要呈味肽的一级质谱图及二级质谱图 Fig.2-5MS and MS/MS spectrum of 3 key flavour peptides (a： F1-3， b：F1-5，c：F1-7) 2.5化学合成肽的呈味特性分析 以2.4中分离鉴定出的主要呈味肽为目标肽，委托上海强耀生物科技有限公司进行固相化学合成，得到三条小肽分别为： F1T3 (VVTNPSRPW)、F1T5(DPLRYM)和F1T7 (GPDPLRYM)。采用电子舌分析其呈味特性及生NaCl、MSG 的协同效应。 2.5.1 F1T3、F1T5和F1T7的呈味特性 为研究合成呈味肽的滋味特性，将呈味肽超滤浓缩组分F、凝胶分离组分F1及合成肽F1T3、F1T5和F1T7分别用超纯水配成0.5 mgmL'的溶液各80mL，同时配置咸味、鲜味、甜味和酸味的参照溶液，进行电子舌分析，结果见图2-6。PCA图中二维主成分的累积贡献率达到98%，其数据可以代表原始数据信息。由图2-6可知，合成的三条肽链中， F1T3与F、F1滋味最接近，滋味特征最接近鲜味，最有可能是盐水鸭的特征呈味肽： F1T5和F1T7结构相似，滋味也比较接近，离F、F1距离较远，滋味特征最接近咸味：F1T3、F1T5和F1T7的酸味和甜味均较弱。 图2-6合成肽 (F1T3、F1T5和F1T7)的电子舌主成分分析图 Fig. 2-66PPrincipal components analysis for 3 synthetic peptides ( F1T3、F1T5 and F1T7) 2.5.2F1T3、F1T5、F1T7 与 NaC1、MSG的协同效应 为了进一步考察合成肽的鲜味和咸味特征，按表2-3配置了不同浓度的样品溶液进行电子舌分析，以期判断合成呈味肽与 NaCl、MSG 之间的协同效应，结果见图2-7。 表2-3 电子舌待测样品 Table 2-3 The samples determined by the electronic tongue 样品 浓度(mg*mL) 样品 浓度(mg*mL) Sample Concentration Sample Concentration F1T3 0.5 FIT7+MSG 0.5+0.5 F1T3+MSG 0.5+0.5 F1T7+NaCl 0.5+0.5 F1T3+NaCI 0.5+0.5 F1T7+MSG+NaCl 0.5+0.25+0.25 F1T3+MSG+NaCI 0.5+0.25+0.25 MSG1 0.5 FIT5 0.5 MSG2 1 F1T5+MSG 0.5+0.5 MSG3 1.5 F1T5+NaCl 0.5+0.5 NaCl1 0.5 F1T5+MSG+NaCI 0.5+0.25+0.25 NaCl2 1 F1T7 0.5 NaC13 1.5 由图2-7可知，不同浓度梯度的 MSG 和 NaCl 在电子舌 PCA 图中均呈现一定的线性关系：且样品浓度越高，之间的距离越近。说明电子舌对低浓度的 MSG 和NaCl分辨率更高， 当 MSG 和 NaCl的浓度高到一定范围内，它们在 PCA 图上的散点可能会重合，电子舌将无法分辨。向合成肽溶液中加入 MSG、NaCl 和 MSG/NaCl， 溶液滋味均向咸味靠拢，加入 MSG/NaCl 咸味增强效果最明显，说明合成肽与 MSG能发生协同作用增强强味，但合成肽与 NaCl没有鲜味增强作作。 图2-7 1合成肽 (F1T3、FIT5 和F1T7) 与 MSG、NaCl的主成分分析图 Fig. 2-7 PPrincipal components analysis for 3 synthetic peptides (F1T3、F1T5 and F1T7)，MSG and NaCl 3讨论 3.1呈味肽分离条件的优化 3.1.1采用超滤和纳滤 呈味肽的相对分子质量范围迄今没有明确定义，目前已报道的呈味肽一般为相对分子质量小于3000、氨基酸组成小于10个或10个左右的寡肽；且肽链越长，味感越不明显。超滤是一种快速、有效地获得并浓缩目沐分子质量的肽的方法， Su等118和Noguchi 等采用分级超滤分别对花生水解物、鱼蛋白水解物中呈味肽进行分离纯化，结果表明呈味性强的一般为小分子质量的分离组分。故本试验首先选用相对分子质量截留3000的超滤膜对呈味肽提取液进行超滤，去除味感较弱的大分子肽和杂质。其次游离氨基酸在含量高于其其值时也有呈味作用20，前人文献均没有提及将氨基酸从小肽提取液中分离出去的步骤，本试验将分子量小于3000的超滤液再次通过分子量 截留200的纳滤膜，收集纳滤膜截留的浓缩液组分，基本排除了游离氨基酸对呈味肽提取液的滋味影响，并且起到浓缩宿用。 3.1.2采用Nano-LC-ESI LTQ-Orbitrap MS/MS 联用系统 多肽的种类很多，大多具有相似性，使用单一的分离鉴定手段往往不能达到理想的效果，近年来HPLC-MS联用技术在多肽分离鉴定领域已显示出巨大的优越性。与MS相连的LC可以起到一个预分离和富集的作用，减少了离子之间鉴定的干扰性，同时降低样品的损耗和污染，因此LC-MS的精确度和灵敏度都大大超过常规的检测方法[21] 与传统的液相色谱相比，纳升流速的液相色谱使被分析物的单位浓度显著提高，灵敏度达到最佳，能够有效分析低丰度/低离子化效率的肽段。ESI-MS 分析小分子多肽具有极高的灵敏度和精确度，并且可以与液相色谱很好的实现在线联用(LC-MS)。纳升级电喷雾技术的使用使初始粒径更小，初始荷质比非常高，可以进一步提高灵敏度，与此同时大大降低了样品的使用量，微升级的样品即可满足检测需要21]。线性离子阱高分辨静电场组合质谱仪(LTQ Orbitrap XL)是目前最先进的质谱仪之一，它将线性离子阱的多级质谱功能和 Orbitrap 高分辨能力质谱结合起来，可同时实现多级质谱碎裂和母子离子的高分辨采集，为小肽鉴定与分析提供了更多更准确信息；并具有新的 HCD 八极碰撞单元的特性，可以在 MS/MS 裂解应用中增加灵活性，具有直接从复杂样品中快速、灵敏、可靠的检测化合物的能力[22-23]。 因此，本研究中将 Nano HPLC 系统与带有纳喷离子源的 LTQ Orbitrap XL 质谱仪联用，在保证精确度和检测灵敏度情况下，又大大减少了前处理难度和检测时间，是小肽物质分离鉴定的首选。 3.2盐水鸭中肽的呈味特性 呈味肽因肽链长度、氨基酸组成、氨基酸序列、空间结构的不同而呈现出不同的呈味特性。Spanier等(24)研究指出，亲水性多肽一般与可口滋味相关，如甜味、肉味等，然而疏水性多肽多与不良滋味的产生有关，如苦味肽。当疏水性氨基酸残基(如Leu、Phe、Val等)裸露在肽链的表面时，会刺激舌上的苦味受体(味蕾)产生苦味。鲜味肽的氨基酸序列中一般含有Glu或Asp等酸性氨基酸25]， Glu、Asp、Gln、Asn之间相互结合或与Thr、Ser、Ala、Gly、Met (Cys) 相互结合形成的多元酸钠盐呈鲜味。如Yamasaki等(6从牛肉的木瓜蛋白酶消化液中分离出的牛肉八肽Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala，具有甜味、酸味、鲜味等复合味并能增强牛肉风味、呈现美味味感；但张梅秀等从河豚鱼汤中分离出的呈味八肽序列中不含Glu或Asp， 也具有鲜味和甜 味。此外，含有Glu或Asp的肽段还可能引起食品的浓厚感(kokumi) 滋味7. 从表2对F1组分的鉴定结果可以看出，7条肽链中共有的氨基酸是Pro， Pro对于肽苦味的影响与其他疏水性氨基酸不同， Shinoda等的126]研究发现含有脯氨酸残基的苦肽苦味较温和、愉悦、不难接受，因此推测7条肽链没有强烈的苦味。其中含有Asp和Asn的肽链有5条，分别为VVTNPSRPW、RPPWVTD、DPLRYM、PDPLRYM和GPDPLRYM， 符合鲜味肽的特征，可能是F1组分鲜味强烈的原因。有些鉴定出来的肽在结构上只有细微差异，仅在C端或N端增加或删除一个或两个氨基酸序列，如DPLRYM、PDPLRYM和GPDPLRYM， 说明它们可能来自于相同的蛋白质序列。3条主要呈味肽VVTNPSRPW、DPLRYM和GPDPLRYM是7条肽链中亲水性氨基酸比例最高的，且均含有Asp或Asn，可能产生令人愉悦的鲜味、肉味和浓厚感，对盐水鸭的滋味有一定的贡献。 这些呈味肽对盐水鸭滋味和特征风味的影响并不是这些小肽滋味的简单累积，而是它们相互协同平衡提供其自有滋味。肽不仅本身能呈现一定的滋味，同时还与盐水鸭中其他成分(如氨基酸、无机盐等)发生相互作用，使盐水鸭的总体味感变得协调、醇厚。这种复杂性和综效性使得肽在呈味过程中所起的功能以及呈味机制需要进一步研究和验证。 4结论 盐水鸭的小肽提取液经超滤和凝胶层析分离后得到5个分离组分(F1、F2、F3、F4和F5)，经过感官评定和电子舌分析后发现F1组分的稀释因子最高，达128， 且与超滤组分(F)的滋味特征相似。采用液质联用对呈味特性最强的F1组分进行分离鉴定，得到7条由6~9个氨基酸残基组成的肽链，其中3条肽链可信度和相对离子强度较高，被鉴定为主要呈味肽，其氨基酸序列分别为Gly-Pro-Asp-Pro-Leu-Arg-Tyr-Met(GPDPLRYM)、Asp-Pro-Leu-Arg-Tyr-Met(DPLRYM)、Val-Val-Thr-Asn-Pro-Ser-Arg-Pro-Trp(VVTNPSRPW)。 以鉴定得到的三条呈味肽为目标肽进行固相化学合成，分别得到三个合成肽F1T3、F1T5 和 F1T7。电子舌分析发现， F1T3 与盐水鸭的总体滋味最接近，呈味特性最接近鲜味，最有可能是盐水鸭的特征呈味肽； F1T5和F1T7滋味相近，与盐水鸭总体滋味差异性相对较大，呈味特性最接近咸味； F1T3、F1T5和F1T7的酸味和甜味均较弱。三条合成肽均能与 MSG 发生协同作用增强咸味，但与 NaCl 没有鲜味增强作用。 ( 参考文献 ) ( [1] 戴妍，常海军，兴兴建，等.不 同 二次杀菌处理的南京盐水鸭产品风味变化及感官特性[J]. 南 京农业大学 学 报，2011，34(5)：122-128 ) ( [2] Toelstede S， D unkel A ， H o fmann T. 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