饲料中微生物、动物成分检测方案(PCR)

广州迪澳生物科技有限公司 广州迪澳生物科技有限公司 广州迪澳生物科技有限公司 广州迪澳生物科技有限公司 饲料中致病微生物与动物成分的分子检测可行性方案 2018 年 7 月 19 日 广州迪澳生物科技有限公司 目 录 细菌污染饲料的危害 ............................................................................................... 1 细菌污染饲料引起饲料腐败变质 ··················································· 1 细菌污染饲料对动物的危害 ························································· 1 细菌污染饲料对人类的危害 ························································· 1 疯牛病与动物源性饲料 ........................................................................................... 2 实时恒温扩增荧光 PCR 技术 ................................................................................. 2 产品系列 ................................................................................................................... 3 DEAOU-308C 恒温荧光检测仪 ······················································ 3 配套试剂 ·················································································· 4 售后服务 ·················································································· 5 迪澳恒温扩增荧光检测系统优势 ··················································· 5 实验室检测能力建设 ............................................................................................... 6 致病微生物检测能力 ·································································· 6 动物源性成分检测能力 ······························································· 8 客户案例（部分） ................................................................................................... 9 附件 1. 迪澳恒温扩增荧光检测系统 ....................................................................... 10 附件 2. DEAOU-308C 技术参数表 ........................................................................... 13 附件 3 分子检测流程图 ............................................................................................ 15 饲料是动物的食品，也是动物产品的原料和食品链中的一员，而动物产品中的肉、 蛋、奶等是人类的食品，可见饲料安全即食品安全，它关系着人类的健康。然而，在我国广泛使用的饲料中，大量存在着微生物污染的现象。另外，流行病学证明疯牛病、羊痒病和人的克雅氏病都是由阮病毒通过食物链传播而引起的，含动物源性成分饲料可能是主要诱因。这都给饲料安全埋下了隐患，也进一步给人类健康埋下了不容忽视的隐患。 1 细菌污染饲料的危害 1.1 细菌污染饲料引起饲料腐败变质 当细菌达到一定的数量时，可引起饲料腐败变质。细菌产生的蛋白质分解酶和肽链内切酶，使饲料中的蛋白质分解为氨基酸，随后在适宜条件下，氨基酸进一步分解为各种低分子化合物，使饲料腐败，渗出物增加、发黏，产生特殊难闻的恶臭味。饲料收到细菌污染而发生腐败变质后，就会使饲料产生不良的颜色和气味，饲料适口性降低进而降低动物的采食量，营养价值大幅度降低，并增加了致病菌存在的可能性，引起动物机体的不良反应，有些腐败变质的产物可能直接危害动物机体。 1.2 细菌污染饲料对动物的危害 细菌污染常导致动物发生疾病中毒。致病性大肠杆菌主要通过畜禽的消化道感染， 在畜禽中可引起多种综合症，包括家禽败血症，慢性呼吸道疾病和输卵管炎，仔猪水肿病，羔羊和犊牛痢疾，马和绵羊流产等。由大肠杆菌引起的肠炎型大肠杆菌病，是危害养猪业的主要传染病之一。饲料尤其是动物性蛋白质饲料经常收到沙门菌污染由大肠杆菌引起的禽大肠杆菌性败血症，腹膜炎，输卵管炎等疾病，给养禽业造成的经济损失。 1.3 细菌污染饲料对人类的危害 饲料受细菌污染后，一些病原菌可感染或定植于动物体内，再经食物链传播给人类， 引发人类食源性感染，食源性疾病又称食物中毒。与人类食物中毒关系较密切的主要是沙门菌和致病性大肠杆菌。大肠杆菌也经常危害人类的健康，烹饪欠熟或生的汉堡包几乎与所有大肠杆菌爆发及散发病例的发生有关沙门氏菌对禽类、生猪及其鲜肉制品的感染率最高，蛋类、禽类肉制品和猪肉是人类感染沙门氏菌病的主要渠道。 沙门氏菌是一种严重威胁人类及动物生命健康的人畜共患病原菌，被沙门氏菌污染的饲料往往是人和动物被感染的源头。沙门氏菌属种较多，分布广泛，目前已知有 249 种血清型，可引起人和动物急性胃肠炎、伤寒、败血症以及肠外灶性感染等，已被 FA0 列为 A 类病原微生物。目前国内外均对饲料中沙门氏菌的污染采取了严格的检测及控制措施，我国 GB13078-2001 中规定，畜禽饲料中不得检出沙门氏菌。随着研究的不断深入，微生物学及生化鉴定、免疫学诊断和分子生物学鉴定陆续被应用于饲料中沙门氏菌的检测，取得了一定的成就。 2 疯牛病与动物源性饲料 朊病毒是引起山羊和绵羊痒病以及人的新变异型克雅氏病的病原体。该病毒是具有侵染性并能在宿主细胞内复制的蛋白质颗粒。它只对蛋白酶敏感，经过高温、辐射以及化学药品等处理后依然存活。疯牛病是牛海缩状脑病（BSE）的俗称，起源于羊痒病，给牛饲喂含羊痒病的动物源性饲料就会使牛患病。人食用了患有疯牛病的牛肉、牛脊髓等就会感染致命的新变异型克雅氏病。自从 1986 年 11 月英国宣布发现了首例疯牛病以来，疯牛病在世界范围内迅速蔓延，美国、加拿大、日本、韩国等相继发现疯牛病。英国、美国等相继报道有人死于新变异型克稚氏病。疯牛病给发病国的畜牧业造成毁灭性的打击。 我国把疯牛病列为一类动物疫病。2006 年 4 月农业部第 387 号公告宣布：我国没有疯牛病。为防止该病的传入和发生，农业部采取了一系列有效措施。根据《中华人民共和国动物防疫法》和《中华人民共和国进出境动植物检拨法》以及《饲料和饲料添加剂管理条例》等有关法律法规的规定，严格禁止从发生疯牛病的 23 个国家进口牛及其产品。2001 年 3 月 1 日农业部农牧发（2001）7 号文件《关于禁止在反刍动物饲料中添加和使用动物性饲料的通知》中明确规定禁止在反刍动物饲料中添加和使用动物性饲料。在反刍动物的配合饲料、精料补充料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料等四大类产品中存在添加牛羊源性成分的可能性；在鱼粉、肉粉、肉骨粉等动物性蛋白中也可能掺杂有牛羊源性成分。 3 实时恒温扩增荧光PCR技术 核酸等温扩增技术（isothermal nucleic acid amplification technology）是指一类分子生物学技术的总称，它们能在某一特定的温度下，扩大特定 DNA 或 RNA 片段的拷贝数。与上述两种 PCR 方法相比，核酸等温扩增技术的特点是可在特定温度条件下实现核酸的扩增。由于扩增反应的全过程均在同一温度下进行，使它们对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，可通过加热模块、水浴槽等简单的设备完成反应。实时恒温扩增荧光 PCR 法是核酸等温扩增技术的一种，是通过 Bst-DNA 聚合酶及特异性引物在恒温条件下对特定的核酸片段进行特异性扩增，扩增产物（DNA）与核酸染料结合后发出 荧光信号，根据所产生的扩增曲线判断结果。实时恒温扩增荧光 PCR 法具有如下特点： （1）温度恒定。反应是在连续等温的条件下进行，不用花费时间来改变温度；（2）高效灵敏。在 45-60 min 的时间内，其扩增效率可达到 l0l0 个数量级；扩增模板极限仅为几个拷贝； 特异性强。采用 4/6 条引物，识别 6 个位点，特异的扩增靶基因； 检测费用低。只要一特定的温度就能完成扩增反应，不需要昂贵的精密仪器和特殊试剂，总费用低； 操作简便。不需要进行双链 DNA 的预变性；反应不需要开盖，在一管内即可以完成全部检测； 检测简单。结果可根据有无“S”型曲线进行判断，也可依靠仪器自动判读。 核酸等温扩增技术因其具有高特异性、高效率和快速反应的特点，故从 2003 年开始逐步被用于医学的临床检测，目前主要是病原微生物的检测和传染性疾病的诊断。应用核酸等温扩增技术在动物源性检测方面也有不少报道。Maruyama 等利用核酸等温扩增技术检测携带 stx2 特异基因（其中一种编码毒素的基因）的大肠杆菌 O157:H7。 Ohtsuka 等利用核酸等温扩增技术检测鸡蛋中的沙门氏菌，试验证明，核酸等温扩增技术比培养计数法和 PCR 方法检测的效率都高，110 个样本中，有 10%的阳性样本 PCR 方法漏检，而核酸等温扩增技术的沙门氏菌阳性样本检出率是 100%。程晋霞，曾静等采用核酸等温扩增技术对食品中过敏原牛奶成分进行检测，并与实时荧光定量 PCR 方法对比，结果发现核酸等温扩增技术的检测灵敏度为 0.5%，与 Real-time PCR 方法检测灵敏度相当，69 份实际样本的检测结果与 Real-time PCR 方法一致。另外，冉光耀也在其论文中报告了采用核酸等温扩增技术对猪、狐狸、大鼠、鸡和鸭源性成分进行检测，猪、狐狸、大鼠、鸡和鸭的各引物的灵敏度分别可达到 500fg、500fg、50fg、5pg 和 50fg，具有良好的灵敏度；可检出自制掺假率为 0.01%的模拟样品和用各种热处理方式处理过的生鲜肉；猪源性成分恒温 PCR 检测法与我国出入境检验检疫行业标准方法（SN/T2051- 2008）相比，结果一致性达到了 97.6%。 4 产品系列 主要包括 DEAOU-308C 恒温扩增荧光检测套装、配套试剂及售后技术服务。 4.1 DEAOU-308C恒温荧光检测仪 DEAOU-308C 恒温扩增荧光 PCR 检测仪是由广州迪澳生物科技有限公司自主研发而成，采用现代微系统技术和最新的 LED 过滤处理技术，其检测灵敏度超越了主流的荧光检测系统（DEAOU-308C 恒温扩增荧光检测仪参数详请见附件 2）。 DEAOU-308C 恒温荧光检测仪资质： 1）2014 年 2 月 17 日，获得 ISO9001 质量体系认证证书 2）2014 年 3 月 15 日：仪器企业标准获得备案 3）2014 年 5 月 5 日：获得 CQC 产品认证证书 4）2014 年 11 月 24 日：获得医疗器械注册证 外壳：外观设计专利 软件：软件著作权登记 配套试剂 A.致病菌检测试剂盒（检出限为 103CFU/mL） 产品名称 用途 备注 副溶血性弧菌核酸检测试剂盒 用于检测沙门氏菌 根据检测需要选择核酸检测试剂盒的类别和数量。 霍乱弧菌核酸检测试剂盒 用于检测金黄色葡萄球菌 创伤弧菌核酸检测试剂盒 用于创伤弧菌的检测 沙门氏菌核酸检测试剂盒 用于沙门氏菌的检测 志贺氏菌核酸检测试剂盒 用于志贺氏菌的检测 大肠杆菌 O157 核酸检测试剂盒 用于大肠杆菌 O157 的检测 单增李斯特氏菌核酸检测试剂盒 用于单增李斯特氏菌的检测 金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒 用于金黄色葡萄球菌的检测 霍乱弧菌 O1 型核酸检测试剂盒 用于霍乱弧菌 O1 型的检测 霍乱弧菌 O139 型核酸检测试剂盒 用于霍乱弧菌 O139 型的检测 铜绿假单胞菌核酸检测试剂盒 用于铜绿假单胞菌的检测 阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒 用于阪崎肠杆菌的检测 枯草芽孢杆菌核酸检测试剂盒 用于枯草芽孢杆菌的检测 细菌基因组 DNA 快速提取试剂盒 用于细菌核酸的提取 B.动物源性成分核酸检测试剂盒（检出限为 0.5%） 产品名称 用途 备注 马、驴源性核酸检测试剂盒 用于鉴别马/驴源性成分 根据检测需要选择核酸检测试剂盒的类别和数量。 鸭源性核酸检测试剂盒 用于鉴别鸭源性成分 牛源性成分核酸检测试剂盒 用于鉴别牛源性成分 羊源性成分核酸检测试剂盒 用于鉴别羊源性成分 猪源性成分核酸检测试剂盒 用于鉴别猪源性成分 鹅源性核酸检测试剂盒 用于鉴别鹅源性成分 狐狸源性核酸检测试剂盒 用于鉴别狐狸源性成分 鸡源性核酸检测试剂盒 用于鉴别鸡源性成分 水貂源性核酸检测试剂盒 用于鉴别水貂源性成分 动物组织 DNA 快速提取试剂盒 用于提取饲料中动物成分的核酸 售后服务 可根据客户需求定制开发相关的检测试剂盒产品，建立属于单位特色的检测项目。 提供规范的分子实验室建设方案。 提供人员培训，特派专业工程师上门指导服务，协助建立检测流程，会定期对实验操作人员进行培训。 提供转基因分子检测整体解决方案，在检测中出现的技术问题由专业工程师解答。 迪澳生物提供 7×24h 全方位的技术支持。 4.4 迪澳恒温扩增荧光检测系统优势 检测快速：45 分钟内完成检测，提高工作效率； 结果准确：高灵敏度，高特异性； 操作简易：非专业人员无障碍操作； 多重检测：单次反应可检测 1-16 项不同指标。 5 实验室检测能力建设 5.1 致病微生物检测能力 5.1.1 培养条件 检测项目 预增菌培养基*a 接种比例 培养条件*b 沙门氏菌 GB 4789.4-2016 缓冲蛋白胨水（BPW） 25g/mL（样品）+ 225mL（培养基） 36±1℃，8 h 振荡培养 金黄色葡萄球菌 GB 4789.10-2016 7.5% 氯化钠肉汤 25g/mL（样品）+ 225mL（培养基） 36±1℃，8 h 振荡培养 单核增生李斯特菌 GB 4789.30-2016 李氏增菌肉汤（LB） 25g/mL（样品）+ 225mL（培养基） 30±1℃，8 h 振荡培养 副溶血弧菌 GB 4789.7-2013 3% NaCl 蛋白胨水 25g/mL（样品）+ 225mL（培养基） 36±1℃，8 h 振荡培养 阪崎肠杆菌 GB 4789.40-2016 缓冲蛋白胨水(BPW) 25g/mL（样品）+ 225mL（培养基） 36±1℃，8 h 振荡培养 志贺氏菌 GB 4789.5-2012 志贺氏菌增菌肉汤 25g/mL（样品）+ 225mL（培养基） 41.5±1℃，8 h 厌氧培养 大肠 O157 GB 4789.36-2016 改良 EC 肉汤 25g/mL（样品）+ 225mL（培养基） 36±1℃，8 h 振荡培养 *a：可以选用配好的商品化固体或无菌液体培养基。 *b：培养时间可根据实际情况进行调整，一般建议过夜培养，最短可缩短为 8 小时。 5.1.2 致病微生物检测程序 图 1 致病微生物检测流程图 5.1.3具体步骤 预增菌 称（量）取 25g/mL 样品放入盛有 225mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1min~2min，制成 1∶10 的样品匀液。 样品匀液的 pH 应在 6.5~7.5 之间，必要时分别用 1mol/L NaOH 或 1mol/L HCl 调节。 将均质袋放于培养箱中，参照 2.3 中的培养条件进行预增菌。 核酸提取 将增菌液摇匀，取增菌液 100μL 转移至 DNA 提取管中（已预装 900μL 的 DNA 提取液）。 涡旋震荡混匀，100℃条件下热浴 5-10 分钟。 完成后上清液即为提取的核酸基因组，可用于后续 PCR 扩增。 配制反应体系 试剂配制（在准备区进行，与扩增区分开，冰上操作）若有 n 个待检样品，需配制 n+2 个反应（n 个待检样品+1 个阴性对照+1 个阳性对照），将下表中试剂在 EP 管中混匀，按每管 23 μl 分装至 0.2 ml PCR 管中。 试剂 加入量（μl） 反应液 22 ×（n+2） Bst 聚合酶 1.0 ×（n+2） 总体积 23 ×（n+2） 加样（在标本处理区进行，冰上操作） 在上述含有混匀试剂的 PCR 管中加入 20μl 的密封液（如扩增仪器带热盖可不加密封液），随后加入 2μl 模板（加样顺序为阴性对照、待检样品、阳性对照），10,000 rpm 离心 30s，即可上机检测。 上机检测（在扩增区进行） 将反应管置于仪器恒温扩增荧光检测仪中，编辑实验名称，选择检测时间，点击开始检测。 依据检测试剂盒的说明书进行实验结果的判定。 5.2 动物源性成分检测能力 5.2.1 动物源性成分检测程序 图 2 动物源成分检测流程图 5.2.2具体步骤 （一）核酸提取 a) 取 50-100mg 饲料样本，加入 500μL Buffer A。 b) 涡旋震荡混匀，80℃条件下热浴 10-15 分钟。 c) 离心取 10μL 上清液，用 1mL Buffer B 稀释，即为核酸溶液，可用于后续 PCR 扩增。 配制反应体系 试剂配制（在准备区进行，与扩增区分开，冰上操作）若有 n 个待检样品，需配制 n+2 个反应（n 个待检样品+1 个阴性对照+1 个阳性对照），将下表中试剂在 EP 管中混匀，按每管 23 μl 分装至 0.2 ml PCR 管中。 试剂 加入量（μl） 反应液 22 ×（n+2） Bst 聚合酶 1.0 ×（n+2） 总体积 23 ×（n+2） 加样（在标本处理区进行，冰上操作） 在上述含有混匀试剂的 PCR 管中加入 20μl 的密封液（如扩增仪器带热盖可不加密封液），随后加入 2μl 模板（加样顺序为阴性对照、待检样品、阳性对照），10,000 rpm 离心 30s，即可上机检测。 上机检测（在扩增区进行） 将反应管置于仪器恒温扩增荧光检测仪中，编辑实验名称，选择检测时间，点击开始检测。 依据检测试剂盒的说明书进行实验结果的判定。 6 客户案例（部分） 辽宁禾丰牧业股份有限公司购买 Deaou-308C 恒温荧光检测仪、沙门氏菌核酸检测试剂盒、FMV35S 基因检测试剂盒、CaMV35S 基因检测试剂盒、NOS 基因检测试剂盒、EPSPS 基因检测试剂盒、PAT 基因检测试剂盒，用于饲料中沙门氏菌和转基因成分的检测。 辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心 购买沙门氏菌核酸检测试剂盒用于沙门氏菌的检测；购买 DNA 扩增试剂盒用于科研工作的开展。 山东新希望六和集团有限公司购买 Deaou-308C 恒温荧光检测仪、沙门氏菌核酸检测试剂盒、狐狸源性核酸检测试剂盒，用于饲料中沙门氏菌和狐狸成分的检测。 赣州朱师傅预混饲料事业有限公司购买 Deaou-308C 恒温荧光检测仪、沙门氏菌、大豆内源基因检测试剂盒，用于饲料的配料——啤酒酵母粉中沙门氏菌和大豆成分的检测。 天津正大饲料科技有限公司 购买沙门氏菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法）用于饲料中沙门氏菌的检测。 河南省畜牧局使用 Deaou-308C 恒温荧光检测仪、沙门氏菌核酸检测试剂盒、金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒、牛源性成分核酸检测试剂盒、羊源性成分核酸检测试剂盒，用于饲料中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和动物成分的检测。 广州迪澳生物科技有限公司 广州迪澳生物科技有限公司 广州迪澳生物科技有限公司 1 1 1 广州迪澳生物科技有限公司 附件 1. 迪澳恒温扩增荧光检测系统 迪澳生物提供的恒温荧光 PCR 检测解决方案，简便易行，主要仪器设备 可浓缩在一个行李箱大小的空间（图 3）；检测操作也相当简单；自主开发的恒温荧光检测仪可实现结果自动判断，以“+”和“−”号表示阳性和阴性结果，无需专家解读；因此可以为贵单位提供准确、先进的检测手段的同时，节约实验室建设投入。 图 3 迪澳恒温扩增荧光检测箱 10 广州迪澳生物科技有限公司 序号 产品名称 图片 技术参数 用途 数量 1 恒温扩增荧光检测仪 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 检测原理：基于实时荧光信号检测的恒温 PCR 技术，无需升降温即可完成实验，可用于微生物、动物源性等项目的实时检测。 检测孔：≥16 孔；反应体积：10～100µL；设备移动后无需校准，兼容常规分子实验耗材。检测仪器自带触屏显示功能。 简单的结果显示方式：1）扩增曲线；2）出峰时间；3）检测结果。 结果打印：设备有打印输出功能，可连接热敏打印机实时打印检测结果。 系统功能 1：独立系统，通过屏幕操作；仪器中可实现数据的存储、调出、结果分析、统计和报告；全中文的检测系统操作界面和电脑端操作软件，软件免费更新。 系统功能 2：具有数据通信端口，可上传检测数据。 动物源性食品，食源性致病菌等检测项目 1 2 迷你离心机 1. 2. 3. 4. 5. 转速：10000 转/分相对离心力：约 7500g 外型尺寸：176×156×121（mm）样品处理量：8×2.0mL/1.5mL/0.5mL/0.2mL 离心管 （另配 0.5mL 和 0.2mL 离心套管）定时范围：5s—99min59s 样品处理 1 11 广州迪澳生物科技有限公司 3 金属浴 1. 2. 3. 4. 5. 控温范围：室温+5℃-100℃ 模块温度均匀性：≤±0.3℃ 温度显示精度：0.1℃ 最高温度：100℃ 产品重量：≤1kg 样品处理 1 4 快速混匀器 1. 2. 3. 4. 5. 振荡方式：圆周振荡 周转直径：4.5 mm 振荡量(1 个试管)：max. 50mL 振荡转速：3,300rpm 外形尺寸：110×70 mm 样品处理 1 5 移液器 1. 2. 3. 规格 100 - 1000μL 规格 10 - 100μL 规格 0.5 - 10μL 样品处理 3 表 1 迪澳恒温扩增荧光检测系统设备与参数 12 附件 2. DEAOU-308C 技术参数表 描述 特性 工作电压 100～240V，50～60Hz 最适工作环境温度 15～30℃ 储存温度 ﹣20℃～+55℃ 环境相对湿度 20%～85% 电源 19.5V 6.15A 加热方式 半导体 升温速率 1℃/秒以上 温控范围 室温～85℃ 控温精度 ±0.2℃ 温度准确度 ±1℃ 模块温度均匀度 ±1℃ 热盖 具有热盖功能 检测孔 16 孔 反应体积 10～100 µl 耗材 0.2ml 离心管或 8 联管 检测方式 实时荧光信号检测 检测光源 LED 灯 滤光系统 双色荧光滤光片（460-480nm，510-530 nm） 激发光波长 470nm 检测光波长 520nm 定性或定量 可进行定性和半定量检测 结果显示方式 1）扩增曲线；2）出峰时间；3）检测结果 判读方式 1）根据扩增曲线判读；2)仪器自动判读 检测试剂 开放式恒温荧光检测试剂 操作软件 安卓软件及计算机软件 控制方式 本机触屏或计算机 最大反应时间 180 分钟 尺寸 长375mm×宽315mm×高135mm 净重量 4.45 kg 外接设备 电脑（自备） 技术资料 全套安装、操作和维护使用说明书 软件更新 软件免费更新 质量保修期 1 年免费维修，3 年维护 资质 ISO 9001 质量认证，CQC 认证 附件 3 分子检测流程图 图 4 动物源性分子检测流程图 图 5 致病微生物分子检测流程 13 13 13 饲料是动物的食品，也是动物产品的原料和食品链中的一员，而动物产品中的肉、蛋、奶等是人类的食品，可见饲料安全即食品安全，它关系着人类的健康。然而，在我国广泛使用的饲料中，大量存在着微生物污染的现象。另外，流行病学证明疯牛病、羊痒病和人的克雅氏病都是由阮病毒通过食物链传播而引起的，含动物源性成分饲料可能是主要诱因。这都给饲料安全埋下了隐患，也进一步给人类健康埋下了不容忽视的隐患。