中药材、中成药、饮片、药物制剂中农药检测方案(均质器)

中药材中农药使用现状 部分参与药典制订的单位 品Detelogy 中药检测样品应用简介(2341农残通则) www.detelogy.com 中农药使用对象以种植型药材为主 地下病虫害普遍发生，如人参、三七、枸杞病虫害较多 实行农药登记品种较少，部分地区缺少规范，监管几乎空白 对预防不重视，发生病虫害后猛增用药量 组织化程度低，没有精准施药，农药利用率偏低 仓促上市，可能会忽视农药安全间隔期 农药登记、农药管理待完善 农药安全间隔期：是指最后一次施药至收获(采收)使用、消耗作物前的时期，自喷药后到残留量降到最大允许残留量所需间隔时间。 中国食品药品检定研究院(人参) 中国医学科学院药用植物研究所(金银花) 河北省药品检验研究院(大枣) 四川省食品药品检验检测院(麦麦) 广州市药品检验所(陈皮) 上海市食品药品检验所(三七) 重庆市食品药品检验检测研究院(党参) 农业农村部农药检定所(枸杞) 浙江省食品药品检验研究所(菊花) No. 内容 2015药典 2020药典 第一法 GC色谱法1 有机氯类农残测定 9种 9种 GC色谱法2 22种 22种 有机氯类农残测定 第二法 GC色谱法 有机磷类农残测定 12种 12种 第三法 GC色谱法 拟除虫菊酯类 农残测定 3种 3种 第四法 GC-MS/MS农药多残留测定 74种+2种ISTD检出限0.005~0.05mg/kg 88种+3种ISTD检出限0.005~0.1mg/kg LC-MS/MS农药多残留测定 153种+2种ISTD 检出限0.005~0.25mg/kg 523种+3种ISTD 检出限0.005~0.25mg/kg 第五法(新增) 药材及饮片(植物类)中禁用农药多残留测定(GC-MS/MS法) (LC-MS/MS法) 33类 (55个化合物)禁限用农药，不得检出(0.01~0.2mg/kg) ISTD-内法法、内标物 ESTD-外标法 方法 农药类型 取样量 涡旋混合 固相萃取 浓缩设备 其他仪器 三号筛 MultiVortex QSE-12/24 MFV-12/24/36 FV64/64UP FlexiVap-12/24 第一法 有机氯类9种 2g 约35ml-近干 刻度浓缩瓶 约35ml-近干刻度浓缩瓶 超声提取仪、离心机 有机氯类-22种-GPC 1.5g √ GPC后使用QSE 10ml-近千 10ml-近干 GPC凝胶色谱、离心机 第二法 有机磷类12种 5g √石墨化炭小柱 过柱后 5ml-近干 过柱后5ml-近干 预浓缩约150-80ml样品-近干 冰浴超声、离心机 第三法 拟除虫菊酯3种 1-2g √ 浓缩约90ml羊品-近干 超声提取、装填小柱、离心机 取样品粉末2g，加水20ml，浸泡过夜 理30分钟 图 刻度浓缩瓶 加氯化钠6g，二氯甲烷30ml， 超声15min 预浓缩： FlexiVap-24 第2次浓缩：MFV系列 方法 农药类型 取样量 涡旋混合 固相萃取 浓缩设备 其他仪器 三号筛 MultiVortex QSE-12/24 MFV-12/24/36 FV64/64U FlexiVap-12/24 第四法 农药多残留-88种-气质 3g √多次使用 浓缩5ml至0.4ml 浓缩5ml至0.4ml 分散填料柱净化、离心机 农药多残留-523种-液 同上 同上 同上 同上 同上 同上 MoreIntelligent，MoreEfficient 新增第5法：药材及饮片(植物类)中禁用农药多残留测定法 样品前处理方式 方法概述 适用药材 药材适用性说明 直接提取 乙腈高速均浆提取 人参、党参、当归 基质简单的药材 QuEChERS 分散填料：(无水硫酸镁900mg，IV-丙基乙二胺300mg，十八烷基硅烷键合硅胶300mg， 硅胶300mg， 石墨化碳黑90mg) 三七、麦冬、大枣等 基质复杂的药材 固相萃取 分散填料：无水硫酸镁1200mg， N-丙基乙二胺300mg，十八烷基硅烷键合硅胶100mg 陈皮、菊花等 挥发油和色素较多 HLB小柱 (200mg， 6m) 陈皮等 挥发油多 小柱carb/NH， (500mg/500mg，6ml) 枸杞、金银花等 色素多 Tips： 石墨化碳黑可除色素和挥发油，对对磺隆类农药(甲磺隆、苯胺磺隆、氯磺隆等)[吸附性较大，易造成回收率偏低，需根据具体实验结果调整配比。 2020中国药典2341农残测定方法新增第5法-智能前处理设备建议选型 MHS-60多样品均质系统直接提取法 FlexiVap-24全自动智能平行浓缩仪直接提取法 QuEChERS， 固相萃取法 FV64UP 全自动智能双模式氮吹仪QuEChERS， 固相萃取法 QSE-12/24固相萃取装置固相萃取法 均质提取 100ml均质管加入5g试样(过三号筛)，加入1g氯化钠摇匀 力加入50ml乙腈，使用MHS-60进行井质(120s， 12000rpm) 离心处理样品(4000rpm)，上清液转移至100ml浓缩管 往均质管沉淀中加入50ml乙腈，MHS-60再次均质(60s，12000rpm) 浓缩定容 .再次离心处理样品，合并两次提取液至浓缩管 使用FlexiVap-24浓缩样品至3—5ml ●待样品冷却至常温，用乙腈稀释至 10.0ml， 混匀 同时均质6位样品 批量浓缩24个100ml样品 注意事项 1.高糖分的样品，均质提取前可加入适量水，减少加入乙腈后的聚合现象。 2.避免高速均质时，均质刀头过发热。 3. 离心后上清液转移到浓缩瓶时，可在浓缩杯上放滤纸漏斗，避免残渣进入浓缩瓶。 4. 为避免待测物分解和损失，浓缩温度不超40℃。 同时均质6位样品 2020中国药典2341农残测定方法新增第5法前处理--QQuEChERS基质复杂：三七、麦冬、大枣 12位50ml、100ml离心管26位15ml离心管 双氮吹模式：涡旋与针追随10.1寸高清屏，64位通道 针追随样品液面自动下降10.1寸高清屏，64位通道 准确称量3g试样(过3号筛)于50ml聚苯乙烯具塞离心管中 加人1%冰醋酸溶液15ml， 使用MultiVortex涡旋1min 静置样品30min后，准确加入15ml乙腈 MultiVortex涡旋混匀，震荡样品5min 加人无水硫酸镁与无水乙酸钠(4：1)的7.5g混合粉剂 迅速摇匀样品，剧烈振荡样品3min 样品置于冰浴中冷却10min， 离心 (5min， 4000rpm) 取9ml上清液，加入已装有分散填料的15ml具塞离心管(无水硫酸镁900mg， IV-丙基乙二胺300mg， 十八烷基硅烷键合硅胶300mg， 硅胶300mg，石墨化碳黑90mg) MultiVortex涡旋混匀，震荡样品5min 离心处理 (5min， 4000rpm)，准确吸取上5ml清液 使用MFV或FV64系列水浴氮吹浓缩上清液(40℃)，至至0.4ml左右 加入乙乙定容至1.0ml， 混匀后经0.22um滤膜过滤。 2020中国药典2341农残测定方法新增第5法前处理-i-QQuEChERS基质复杂：三七、麦冬、大枣 12位50ml、100ml离心管26位15ml离心管 双氮吹模式：涡旋与针追随10.1寸高清屏，64位通道 针追随样品液面自动下降10.1寸高清屏，64位通道 QuEChERS的含义 Quick、Easy、Cheap、、EEffective、Rugged、Safe QuEChERS的优势 提取、净化步骤可同时进行 节省提取溶剂用量 减少前处理用时 减少需要使用的设备(不用过柱) 降低前处理成本 分散填料Tips：石墨化碳黑可除色素和挥发油，但对磺隆类农药(甲磺隆、苯胺磺隆、氯磺隆等)吸附性较大，易造成回收率偏低，需根据具体实验结果调整配比。 QSE-12/24 固相萃取装置 1.分散填料净化 (无水硫酸镁1200mg， N -丙基乙二胺300mg，十八烷基硅烷键合硅胶100mg) 1.15ml具盖离心管中按配比加入分散填料 2.量取3-5ml由直接提取去制备的样品， 3. MultiVortex涡旋混匀，震荡样品5min(500rpm) 4.离心处理样品，取上清液 2.HLB固相萃取柱(200mg，6m) 1.量取3-5ml直接提取法制备的样品溶液 2.通过HLB固相萃取柱净化，收集全部净化液。 3.Carb/NH2固相萃取柱 (500mg/500mg，6ml) 1.量取2ml直接提取法制备的样品溶液 2.预处理：10m乙腈-甲苯混合 (3：1)溶液过柱 样品过柱：保持填料湿润，2ml样品溶液过柱 4洗脱：20ml乙腈-甲苯混合(3：1)溶液过柱56 使用MFV或FV64系列浓缩洗脱液至近干 加入乙乙回溶样品，转移样品，定容至2.0ml。 样品净化：固相萃取流程 1.基质效应：：内源性物质对待测农残指标的影响 2.基质匹配法：用于制备混合标准工作溶液，改善或消除基质效应，提高定量分析准确度。 3.空白基质样品：经检测不含待测农药的同品种样品 4.空白基质溶液的制备：同供试品溶液的制备方法 5.要求：相关系数一般大于0.99，筛查方法的要求可放宽至0.98 新增第5法-基质混合标准工作溶液的制备备(3(基质匹配法) 制备： 12位50ml、100ml离心管26位15ml离心管 分别精密量取空白基质溶液 1.0ml(6份)使用水浴氮吹仪，将6份空白基质溶液 在40C 浓缩至约 0.6ml 双氮吹模式：涡旋与针追随10.1寸高清屏，64立通道 分别加人混合对照品溶液10ul、20pl、 50ul、 100ul、、150ul、200ul加乙腈稀释至Iml，涡旋混匀，即得混合标准工作溶液。 线性范围20倍： 标示浓度为1、2、5、10、15、20ng/ml， 其中5ng/ml为定量限浓度中浓度点5ng/ml为限度点(0.5g生药/ml) 不建议调整标准曲线范围 针追随样品液面自动下降10.1寸高清屏，64位通道 2020中国药典2341农残测定方法-新增第五法气相色谱-串联质谱法-(测31种) 色谱条件 弹性石英毛细管柱：用(50%苯基)-甲基聚硅氧烷为固定液(柱长为30m，柱内径为0.25mm， 膜厚度为 0.25/xm)。 进样口温度250°C，不分流进样。 恒压模式进样口，柱前压力为146kPa。 载气：高纯氦气(He)。 程序升温 1 在60℃初始温度下，保温1min 2 升温至120℃(速度30℃/min) 3 升温至160℃(速度10℃/min) 4 升温至230℃(速度2℃/min) 5 升温至300℃(速度15℃/min)，保呆6min 质谱条件 三重四极杆串联质谱仪 离子源：电子轰击源(EI)，温度250℃ 碰撞气：氮气或氩气 质谱传输接口温度250℃ 质谱监测模式：多反应监测(MRM) 测定操作 1.分别准确吸取样品溶液和基质混合对照溶 4.进样至气相色谱-串联质谱仪分析 液各1ml2.分别准确加入0.3m磷酸三苯酯内标溶液3.混匀后，经0.22um滤膜过滤至进样瓶 5.按内标标准曲线法计算 2020中国药典2341农残测定方法-新增第五法液相色谱-串联质谱法-(测30种) 色谱条件 柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶 (柱长10cm，内径为2.1mm，粒径为2.6um) 流动相A：0.1%甲酸溶液(含5mmol/L甲酸铵) 流动相B：：Z乙腈-0.1%甲酸溶液(含5mmol/L甲酸铵) (95：5) 流动相梯度(流速：0.3ml/min，柱温40℃) 时间 (min) 流动相A(%) 流动相B(%) 0-1 70 30 1-12 70→0 30100 12-14 0 100 质谱条件 三重四极杆串联质谱仪 离子源：电喷雾(ESI)离子源 模式：正离子扫描模式 质谱监测模式：多反应监测(MRM) 2020中国药典2341农残测定方法-新增第五法测定内容&报告 测定内容 1.1标准曲线 2.回收样品(限度点，测2-3个平行样) 3.5对照品相应浓度点精密度(进样三次) 4.待测样品 (已有方法-平行样2-3个，各进样三次) (建立方法-平行样6个，各进样三次) 报告 1.3当样品中有目标待测物检出，结果应表示为残留量的数值形式，单位为mg/kg (或ug/kg)；未检出或检出浓度低于检出限时，结果应表示为未检出(检出限为**mg/kg)，或者表示为<检出限**mg/kg. 2.报告结结时，有效位数应与限量标准一致。未明确规定限量标准时， 0.001~0.01mg/kg的结果可取整到一位有效数字；0.01-10mg/kg的结果取整到2位有效数字，≥10mg/kg的结果取到3位有效数字。 3. 有检测或者有超标的结果务必进行验证。 总则 本指导原则提供依照法定标准检测中药有害残留物时，方法确认、偏离和日常检测分析质量控制应遵循的主要技术要求。 中药有害残留物检测主要包括重金属有害元素，农药、真菌毒素等残留测定，由于中药基质复杂，待测物理化性质各异，且多属于痕量分析范畴，必须建立适宜的分析质量控制体系，保障结果准确可靠。 方法确认A 基于残留检测的痕量分析特点，方法确认时应重点关注线性、专属性、准确度、精密度和基准效应。 方法偏离 应评估这些改变对检测结果的影响，根据影响程度进行必要的验证，一般应包括准确度、重复性、专属性等。 MHS-60多样品均质系统2341通则-100ml试管架2351通则-180ml试管架刀头10mm或18mm MultiVortex 多样品涡旋混合器 标准配置已包含12位/26位试管架 50ml离心管X50支 15ml离心管X100支 连购三台特惠、质保延长 QSE-12/24 固相萃取装置 必备耗材 2341通则：HLB小柱、石墨化炭小柱、氨基柱 2351通则：免疫亲和柱、展青霉素净化柱、HLB小柱 MFV-12/24试管规格：试管、离心管、圆底烧瓶， MFV-36试管规格： 试管、离心管 锥形瓶等尺寸范围：010-35mm、H32-200mm体积范围：1-150ml 尺寸范围：010-29mm、 H32-200mm 体积范围：1-100ml DDetelogy FV64 Detelogy 全自动智能氮吹仪针追随式 FV64UP全自动智能双模式氮吹仪针追随式+涡旋式氮吹 LI 2341、2351均须使用，建议选配 15ml具塞刻度离心管(64位管架) 50ml具塞刻度离心管(32位管架) FlexiVap-24 2341需使用，2351不需使用(小样品) 全自动智能平行浓缩仪 标配含100ml尾管浓缩杯48个 THANK YOU MoreIntelligent，MoreEfficient MoreIntelligent，MoreEfficient 《中国药典》2020版已正式实施，整顿大潮即将席卷我国药业。对于业界关注度颇高的中药农残问题，新版药典0212通则对药材及饮片（植物类）要求33类禁限用农药不得检出（不得过定量限），2341通则第四法检测农药种类由153增加至523种，并增设第五法专用于禁用农药残留检测（气相色谱-串联质谱法/高效高效液相色谱-串联质谱法）。一  2341通则对比第五法中，GC-MS可测定31种禁用农药，LC-MS测定30种，其中10种农药能同时被GC-MS和LC-MS测定，分别为：杀虫脒、蝇毒磷、水胺硫磷、内吸磷、久效磷、甲基异柳磷、甲拌磷、苯线磷、灭线磷、治螟磷。第五法的前处理分为直接提取法、固相萃取法以及QuEChERS法。Tipsl 石墨化碳黑可除色素和挥发油，但对磺隆类农药（甲磺隆、苯胺磺隆、氯磺隆等）吸附性较大，易造成回收率偏低，需根据具体实验结果调整配笔。l 前处理全程保证不高于40℃。二  2341新增第五法前处理环节1.直接提取法均质提取• 100ml均质管加入5g试样（三号筛），加入1g氯化钠摇匀• 加入50ml乙腈，使用MHS-60均质（12000rpm，2min）• 离心处理样品（4000rpm），上清液转移至100ml浓缩管• 均质管沉淀中加入50ml乙腈，MHS-60再次均质• 再次离心处理样品，合并两次提取液至浓缩管浓缩定容• 通过FlexiVap-24/MFV浓缩样品至3—5ml• 样品冷却至常温，用乙腈稀释至10.0ml，混匀2.QuEChERS• 准确称量3g试样（过3号筛）于50ml离心管中• 加入1%冰醋酸溶液15ml，MultiVortex涡旋1min• 静置样品30min后，准确加入15ml乙腈• MultiVortex涡旋混匀，震荡样品（500rpm，5min）• 加入无水硫酸镁与乙酸钠(4:1)的7. 5g混合粉剂• 迅速摇匀样品，剧烈振荡样品（500rpm，3min）• 样品置于冰浴中冷却10min，离心（4000rpm，5min）• 取9ml上清液，加入装有分散填料的15ml具塞离心管（分散填料：无水硫酸镁900mg，N-丙基乙二胺300mg, 十八烷基硅烷键合硅胶300mg，硅胶300mg，石墨化碳黑90mg）• MultiVortex涡旋混匀，震荡样品（500rpm，5min）• 离心（4000rpm，5min），准确吸取5ml上清液• 使用MFV/FV64氮吹浓缩上清液至约0.4ml• 乙腈定容至1.0ml，混匀后经0.22μm滤膜过滤3.固相萃取法分散填料净化（无水硫酸镁1200mg， N -丙基乙二胺300mg，十八烷基硅烷键合硅胶100mg）• 15ml具盖离心管中加入填料• 取3-5ml由直接提取法制备的样品溶液• MultiVortex涡旋（500rpm，5min）• 离心处理样品，取上清液HLB柱（200mg，6ml）• 量取3-5ml直接提取法制备的样品溶液• 通过HLB固相萃取柱净化，收集全部净化液Carb/NH2柱（500mg/500mg，6ml）• 量取2ml直接提取法制备的样品溶液• 预处理：10m乙腈-甲苯混合（3:1）溶液• 样品过柱：保持填料湿润，2ml样品过柱•  洗脱：20ml乙腈-甲苯混合（3:1）溶液• 使用MFV/FV64系列浓缩洗脱液至近干• 乙腈回溶并转移样品，定容至2.0ml，混匀。