精草铵膦原药中L-草铵膦的质量分数和比例检测方案(液相色谱仪)

使用柱前在线自动衍生-反相色谱法测定精草铵膦原药中L-草铵膦的质量分数和比例 作者 摘要 杨新磊 利用自动进样器的可编程功能，先将精草铵膦原药与衍生试剂在自动进样针内完成衍生，再进入反相色谱柱进行分离检测。D-草铵膦和L-草铵膦在 2.5-250 pg/mL 范围内线性良好， 2.5 ug/mL 下D-草铵膦和L-草铵膦的信噪比分别为65和60。自动化程序保证了方法的稳定性和便捷性，同时可以大幅提高样品检测通量。 草铵膦作为一种广谱除草剂，其市场规模相比于草甘膦要小很多。然而，随着抗草甘膦杂草的增加以及百草枯的禁用，草铵膦将获得巨大的应用前景和发展空间"。目前市售草铵膦多为外消旋体，含有L型和D型两种构型，其中L型为真正具有除草活性的构型。因此，在草铵膦的生产和施用过程中，会因D型的存在而导致产能消耗和环境污染。近年来，国内多家农药企业相继宣称突破了精草铵铵生产的技术壁垒，可实现万吨级生产规模，由此必将极大推动精草铵膦市场的发展。 精草铵膦原药和制剂的质量控制指标一般包含精草铵膦的质量分数、L-草铵膦比例、pH值范围和水不溶物等。其中精草铵膦的质量分数主要通过阴离子交换-高效液相色谱法测定，而L-草铵膦比例的测定方法则比较多，包括手性色谱柱直接测定法2.4、柱前离线衍生-反相色谱法等15-6。其中，采用冠醚手性色谱柱的直接测定法比较简单，但色谱柱成本相对较高且流动相需要用到高氯酸；柱前衍生法，在衍生后采用常规反相柱即可，但手动衍生操作不利于样品的连续分析，样品通量有限。 本方法参考氨基酸自动衍生方案17-8，利用自动进样器使草铵膦外消旋体与邻苯二甲醛(OPA)和N-乙酰-L-半胱氨酸 (NAC) 反应生成一对非对映异构体(L-草铵膦衍生物和D-草铵膦衍生物)，然后利用反相 C18色谱完成分离。衍生化机理如图1所示。 图1.草铵粦衍生反应机理 试剂和样品 甲醇、乙腈和无水乙醇为色谱纯，购自默克；去离子水为 MilliQ 纯水机新制；5 mol/L 醋酸铵溶液购自 Sigma-Aldrich；醋酸、磷酸和三乙胺为色谱纯，购自迪马公司；邻苯二甲醛(OPA) 和N-乙酰-L-半胱氨酸 (NAC) 购自 TCI。草铵膦标样和精草铵膦原药由客户提供。0.4 mol/L 硼酸缓冲液来自安捷伦(仑件号5061-3339)。 仪器和设备 实验使用 Agilent 1260 Infinity Ⅱl 二元液相色谱系统，该系统包含以下组件：1260二元泵(部件号 G7112B)、1260自动进样器(部件号 G7129A)、1260柱温箱(部件号 G7116A)和1260紫外检测器(部件号 G7114A)。所用色谱柱为 Agilent Poroshell120EC-C18， 4.6×100 mm， 2.7 um (部件号：695975-902)，软件为 Agilent Openlab CDS 2.4。 衍生化试剂、标准品溶液和样品溶液准备 分别称取 10 mg OPA 和 12 mg NAC 用1 mL 无水乙醇溶解后，再 加入4 mL 0.4 mol/L 硼酸缓冲盐，摇匀后作为衍生试剂溶液，保 存于4℃的冰箱中，使用周期为7天。取1mL磷酸用水稀释到 100mL 作为衍生反应终止和稀释液，保存于4℃的冰箱中待用。 准确称取100.0 mg 草铵膦标样用水溶解并定容至100mL， 将此溶液作为L-草铵膦(500 ug/mL) 和D-草铵膦 (500 pg/mL) 混合储备液，保存于4℃的冰箱，待用。将此混合储备液用水依次稀释成250、100、50、10、2.5 pg/mL 标准工作溶液，用于绘制L-草铵膦和D-草铵膦的标准曲线。准确称取 25.0 mg精草铵膦原药用水溶解并定容至100 mL， 得到 250 pg/mL 精草铵膦样品溶液，待用。 自动进样器方法 自动进样器在线衍生程序见表1。其中，位置 P2-F2为衍生试剂溶液，位置P2-F3为0.1%磷酸溶液。 表1.自动进样器衍生程序 功能/动作 参数 吸取 吸取2pL衍生试剂溶液(P2-F2)，默认速度 清洗 清洗口，3秒 吸取 吸取样品，默认体积，默认速度 清洗 清洗口，3秒 吸取 吸取1pL衍生试剂溶液(P2-F2)，默认速度 混合 在空气中混合3pL，10次，默认速度 等待 1分钟 吸取 吸取4pL稀释剂(P2-F3)，默认速度 混合 在空气中混合10 pL，8次，默认速度 清洗 清洗口，3秒 进样 进样 液相色谱方法 色谱柱： Agilent Poroshell 120 EC-C18， 4.6×100 mm，2.7 pm柱温： 35°C流动相A： 50 mmol/L醋酸铵溶液(含0.1%三乙胺)，用醋酸将 pH 调节至5.5流动相B： 甲醇流速： 1mL/min梯度程序： 时间(min) B (%)0 866.51010.1 812 8进样量： 1 pL检测波长： 338nm，10Hz 流动相的选择 流动相(尤其是水相)的选择对于可离子化的化合物分离和保留至关重要。本实验需要分离的是一组非对映异构体，分离难度较大，因此考察了不同流动相 pH 以及缓冲盐种类对分离的影响。考察了4种不同流动相，分别是：50 mmol/L 磷酸二氢钾溶液(pH2.5)、50 mmol/L醋酸铵 (pH 4.5)、50 mmol/L 醋酸铵 (pH5.5)和 50 mmol/L 磷酸二氢钾溶液 (pH6.5)。结果如图2所示。从中可以看出，随着 pH的增加，草铵膦衍生产物的保留越来越弱；异构体的分离也发生较大变化， pH 2.5时异构体没有分离迹象， pH 5.5时分离度最高， pH 6.5时分离度又开始下降。为进一步改善衍生产物的拖尾问题，最终选择的流动相为 50 mmol/L醋酸铵溶液，并添加0.1%三乙胺后再用醋酸将 pH 调节至5.5。 图2.不同 pH下草铵膦衍生产物的分离 衍生时间的选择 衍生试剂 (OPA/NAC) 与草铵膦反应的充分程度不仅影响色谱分析的重现性，而且影响衍生产物的检测限。为保证衍生反应完全，考察了不同衍生时间对峰面积的影响。如表1所示，可以通过等待(Wait)时间来改变衍生时间。本研究分别考察了1、3、5、7和10分钟的等待时间。结果得到的草铵膦衍生产物的峰面积变化波动小于1%，据此认为在1分钟的等待时间内，草铵膦已经完成与衍生试剂的反应。因此，本方法最终选择的等待时间为1分钟。 典型色谱图 通过上述优化后的方法，检测草铵膦标准溶液(L-草铵膦和D-草铵膦标准混合液)，得到草铵膦典型色谱图如图3所示，可以看出L-草铵膦和D-草铵膦得到了完全分离。 图3.草铵膦典型色谱图 分离度、重现性、线性范围、检测限和定量限 按实验部分所述的液相色谱方法，取 50 pg/mL 标准工作溶液连续分析6次。结果如表2显示，方法重现性良好，L-草铵膦和D-草铵膦的保留时间相对标准偏差均小于0.1%，峰面积相对标准偏差均小于1.37%。以L-草铵膦与 D-草铵膦的峰面积比例计算，则相对标准偏差为 0.34%(n=6)。本实验L-草铵膦和D-草铵膦分离度可达3.9，与文献报道3的手性柱分离度 (Rs： 4) 相当。 表2.50 pg/mL标准工作溶液连续分析6次结果 进样次数 L-草铵膦 D-草铵膦 L/D 峰面积比 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 1 5.232 85.981 5.917 82.002 1.05 2 5.233 87.981 5.918 83.698 1.05 3 5.238 85.520 5.923 80.830 1.06 4 5.241 88.123 5.926 83.844 1.05 5 5.237 86.973 5.922 82.957 1.05 6 5.246 86.575 5.932 82.422 1.05 RSD% 0.10 1.21 0.09 1.37 0.34 按浓度由低至高的顺序，进样分析标准工作溶液，且每个浓度点进样分析2次。得到L-草铵膦在 2.5-500 pg/mL 范围内的线性回归方程为Y=1.6966X+1.2405，相关系数为R²=0.9999； D-草铵膦在2.5-500 pg/mL 范围内的线性回归方程为Y=1.6541X+0.2883，相关系数为R²=0.9999(见图4)。在2.5 pg/mL 时，L-草铵膦的信噪比为66，按信噪比 S/N =3计算出检测限为 0.125 pg/mL；按信噪比 S/N=10计算出定量限为 0.42 ug/mL。与手性直接测定法相比，本实验开发方法检测限和定量限低了约50倍。 L-草铵膦，5.229 min 样品分析 按样品溶液配制方法，分别称取6份精草铵膦原药样品进行测定，根据L-草铵膦线性回归方程计算精草铵膦的质量分数，并以L-草铵膦和D-草铵膦峰面积计算L-草铵膦占整个草铵膦对映体的百分含量，结果如表3所示。 表3.精草铵膦原药中L-草铵膦的质量分数及百分含量 进样 质量分数(%) L型比例(%) 1 90.1 91.8 2 90.3 92.0 3 90.8 92.3 4 91.1 91.9 5 90.4 92.0 6 91.3 91.9 平均值 90.7 92.0 RSD(%) 0.5 0.2 结论 本研究利用自动进样器将草铵膦衍生后进样分析，完成对精草铵膦原药中L-草铵膦的质量分数以及L-草铵膦占整个草铵膦对映体的百分含量的测定。相比于手动衍生方法，自动进样器自动衍生方式可以准确地控制吸样量、混合速度和次数，衍生反应时间等参数，从而保证方法的稳定性以及高通量分析的可行性。从标样和样品的分析结果看，可以保证本文衍生方法峰面积重现性低于1.5%(n=6)，保留时间重现性低于 0.1%(n=6)。另一方面，衍生后的草铵膦具有很强的紫外吸收官能团，因此与手性分析直接测定相比，可以达到更低的检测限和定量限。同时，草铵膦衍生产物的极性减小，可以利用常规反相 C18 色谱柱进行保留和分离，使用成本也较手性柱有所降低。 ( 参考文献 ) ( 1. 1 董文凯，柴洪伟，解银萍等.化学法合成精草铵膦的研究进展. 现代农药，2016，15(5)：26-29 ) ( 2. 张寒，肖鸣，徐永等.精草铵膦原药高效液相色谱分析方法研 究.现代农药，2017，16(2)：32-33 ) ( 3. 王贤书，张钰萍.手性冠醚柱固定相直接拆分草铵膦对映异构 体.农药，2015，54(9)：638-641 ) ( 4 . 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