尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检测方案(气质联用仪)

SSL-CA20-300Excellence in Science Excellence in ScienceGCMSMS-203 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterTel：86(21)34193996Email： sshzyan@shimadzu.com.cnhttp：//www.shimadzu.com.cn GCMSMS 法测定尿液中的乙基葡萄糖醛酸苷 GCMSMS-203 摘要：本文参考《GA/T 1633-2019 法庭科学血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法》，使用岛津 GCMS-TQ8050 NX三重四极杆气质联用仪，建立了尿液中乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)的分析方法。尿液以乙腈沉淀蛋白，离心，取上清液采用夜生剂衍生化后进样分析。结果表明，在50~1000 ng/mL的浓度范围内， EtG的线性相关系数R为0.9992，线性关系良好，方法检出限为 5.434 ng/mL。取浓度为400 ng/mL的标准溶液重复进样6次，峰面积的相对标准偏差 (RSD%) 为4.0%，精密度良好。采用空白尿液样品，样品加标浓度为 450 ng/mL时，平均回收率为97.2%。本方法操作简单、灵敏度高、准确性好，，可为尿液中乙基葡萄糖醛酸苷的测定提供参考。 关键词：三重四极杆气相色谱质谱联用仪义尿液 乙基葡萄糖醛酸苷 乙基葡萄糖醛酸苷 (Ethyl Glucuronide， EtG) 是乙醇在人体内代谢的标志性代谢物。相较于乙醇，其在血液和尿液中存在时间更久，通常情况下， EtG 在血液和尿液中的存在时间约为12h，血液和尿液中EtG 检测结果是判定个体在12h 内是否饮酒的重要证据，尤其是在体内已不能检测出乙醇时。此外，血液和尿液中 EtG的测定，对判定乙醇来源、区分是否血液腐败产生乙醇有着重要的意义。 目前， EtG的检测方法有 LC-MS/MS 和 GC-MS/MS等。本文参考《GA/T 1633-2019 法庭科学血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法》，使用岛津GCMS-TQ8050 NX三重四极杆气质联用仪，建立了尿液中 EtG 的 GC-MS/MS分析方法。该方法前处理简单，灵敏度和准确度高，适合尿液中的 EtG 检测。 1.1标准品配制 1.0 mg/mL标准物质溶液：采用市售EtG 标准甲醇溶液，置于冰箱中冷藏保存。 10.0 ug/mL EtG标准工作液：吸取0.1 mL 1.0 mg/mL EtG 标准物质溶液，用甲醇稀释定容至10mL，混匀，配制成质量浓度为10.0 ug/mL的标准物质溶液，密封，置于冰箱中冷藏保存。有效期3个月。 1.2样品前处理 样品前处理如图1所示： 图1样品前处理流程图 1.3仪器分析条件 GCMS-TQ8050 NX 三重四极杆气相色谱质谱联用仪 色谱柱： SHRtx-1 (30m×0.25mm×0.25 um)柱温程序： 100℃(1 min)_8℃/min_205℃_30℃/min_280℃(3 min) 载气控制方式：恒线速方式 线速度：37.2 cm/s 进样方式：不分流进样 进样时间：1min 进样体积：1uL 结果与讨论 2.1 EtG 标准溶液谱图 标准溶液质量色谱图见图2， EtG 信息详见表1. 离子化方式：EI(70eV) 离子源温度：220℃ 色谱质谱接口温度：300℃ 碰撞气压力：150 kPa 溶剂延迟时间：2.5 min 检测器电压：+0.5 kV(相对调谐电压) 采集模式：MRM，离子对信息见表2 循环时间：0.3s 图22EtG的质量色谱图(200ng/mL) 表1 乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)的保留时间及 MRM 条件设置 化合物 英文名称 CAS# 保留时间 (min) 目标离子对 CE 参考离子对 CE 乙基葡萄糖醛酸苷 Ethyl Glucuronide 17685-04-0 14.958 261.00>143.10 12 261.00>73.20 27 2.2标准曲线及仪器检出限 空白尿液中分别添加50、100、200、400、800、1000 ng/mL标样，前处理后进样分析，外标法建立校准曲线如图3所示。根据50 ng/mL标样数据，以3倍信噪比计算 EtG 的检出限，线性方程、相关系数R、检出限如表2所示。 图3EtG 标准曲线 表2EtG 标准曲线及仪器检出限(ng/mL) 化合物 线性方程 相关系数R 检出限 (ng/mL) EtG Y=19.57X-324.04 0.9992 5.434 2.3重复性实验 取 400 ng/mLEtG标准溶液，连续进样6次，以峰面积 RSD 考察峰面积重复性，结果如表3。 表3 峰面积重复性结果((RSD%，n=6) 化合物 面积1 面积2 面积3 面积4 面积5 面积6 平均面积 RSD ((%) EtG 7932 8063 7940 8221 8540 7670 8061 4.0 2.4回收率 将 EtG 标准溶液添加到空白尿液样品中，样品加标浓度为450 ng/mL， 按照样品前处理方法制备，分别平行制样6次。回收率结果见表4。 表4加标回收率结果 (ng/mL) 化合物 测试值1 测试值2 测试值3 测试值4 测试值5 测试值6 平均回收率 (%) EtG 434.8 477.7 433.5 433.0 426.5 421.3 97.2 2.5实际样品分析 按照上文所述方法对3个尿液样品进行了前处理并上机测定，谱图如下图4所示，3个样品中均未检出乙基葡萄糖醛酸苷。 图4 尿液样品谱图 结论 本文建立了使用 GCMS-TQ8050 NX 测定尿液中乙基葡萄糖醛酸苷的分析方法。结果表明，在50~1000 ng/mL的浓度范围内， EtG 的线性相关系数 R 为 0.9992，线性关系良好，方法检出限为 5.434 ng/mL。取浓度为400 ng/mL的容准溶液重复进样6次，峰面积的相对标准偏差(RSD%)为4.0%，精密度良好。采用空白尿液样品，样品加标浓度为 450 ng/mL时，平均回收率为97.2%。本方法操作简单、灵敏度高、准确性好，可为尿液中乙基葡萄糖醛酸苷的测定提供参考。 岛津应用云 本文参考《GA/T 1633-2019 法庭科学 血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验 气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法》，使用岛津GCMS-TQ8050NX三重四极杆气质联用仪，建立了尿液中乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)的分析方法。尿液以乙腈沉淀蛋白，离心，取上清液采用衍生剂衍生化，以0.22 μm滤膜过滤后进样分析。以保留时间和离子对相对丰度比为定性依据，空白尿液中加标制作外标法校准曲线，来定量检测样品中乙基葡萄糖醛酸苷含量。结果表明，在50~1000 ng/mL的浓度范围内，EtG的线性相关系数R为0.9992，线性关系良好，方法检出限为5.434 ng/mL。取浓度为400 ng/mL的标准溶液重复进样6次，峰面积的相对标准偏差（RSD%）为4.0 %，精密度良好。采用空白尿液样品，样品加标浓度为450 ng/mL时，平均回收率为97.2 %。本方法操作简单、灵敏度高、准确性好，可为尿液中乙基葡萄糖醛酸苷的测定提供参考。