毛发中四氢大麻酚检测方案(气质联用仪)

应用文献10493热线8008105118电话4006505118www.thermofisher.com赛默飞官方微信SCIENTIFIC thermoscientific 利用 TSQ 9000 三重四极质谱联用仪对毛发中四氢大麻酚进行满足法规要求的高灵敏度测定 作者 简介 Elena Ciceri， Tommaso Albertini， and Andrea Caruso： Thermo Fisher Scientific， Rodano， Milan， Italy 关键词 THCCOOH， 毛发毛发， GC-MS/MS，化学电离，大麻， TSQ 9000 研究目标 利用气相色谱-三重四极杆质谱联用技术测定毛发中11-去甲-9-羧基-THC(THCCOOH)，通过对分析步骤的优化获得最大灵敏度。实现降低氨气消耗的作用。 THCCOOH的分析是毛发分析中最常见的项目。是因为执法部门必须取得个体蓄意使用药物的证据，并证明毛发不是仅仅在空气中被动受到污染。吸食大麻时，人体的毛发由于接触侧流烟雾而间接吸附其中的THC。这使得并未吸食大麻的人会因为毛发被动接触到大麻烟雾而检测出低浓度的 THC。对其代谢物的检测则可区分故意吸食(有效的毒品吸食)与被动污染。大麻在体内的主要代谢产物是11-羟基四氢大麻酚(THC-OH)和 THCCOOH。考虑到外部污染的可能， SAMHSA 已在推荐指导方针中将毛发中大麻的筛查检出限浓度值设为 pg/mg， 并把THCCOH 的确角限浓度值设为 0.05 pg/mg2-5(表1)。 机构组织 检出浓度线 (pg/mg) 毛发测试学会(Society of Hair Testing， SOHT) 0.20 法医与毒理学化学学会(Geslleschaft fur Forensiche 0.05 und Toxikologische Chemie， GFTCh) 药物滥用和精神卫生服务管理局(Substance Abuse and Mental Health Services Administration， 0.05 SAMHSA) △-9四氢大麻酚(THC)是最常见的非法滥用药物，而在其代谢物中虽然 THCCOOH 浓度最高，但在毛发中的浓度仍然非常低6.7(图1)。 图1.THCCOOH 的结构式。 由于毛发中的 THCCOOH 浓度较低，并且可用于分析的毛发样本量都很有限，因此相应的分析具有极大的挑战性。此外，由基质带来化学背景可能会进一步限制分析所需的低浓度水平。虽然免疫学技术具备简单性和快速性等优势而广泛用于检测生物体液中的各类滥用药物，但由于其假阴性和假阳性的比例较高，并不适合鉴定毛发中药物8-10。 在过去几年中，其他如液相色谱质谱联用仪等技术等也有一些针对研究。但大多数情况下无法满足如此低的检出限要求。在本研究中，我们利用了能够提高信噪比的检测技术(GC-MS/MS)，建立了一种灵敏、高选择性、能在皮克级实现毛发中 THCCOOH 定量分析的方法。 样品前处理 本研究所用药物的所有工作溶液均购自 Cerilliant(LGC标准)的认证标准溶液人工制备的。 有机溶剂购自赛默飞世尔科技。所用的衍生试剂包括：五氟丙酸酐(PFPA))(P/NTS65193)和六氟异丙醇(HFIP) (Sigma-Aldrich S.r.l.)。50毫克的毛发样品用2-3毫升二氯甲烷洗净，切成10-20毫米小段。样品中加入入代内标(20 pg THCCOOH-d3)后置于75℃下加入1毫升5M氢氧化钠水解45分钟。制备四个水平的工作曲线(0.05，0.2，0.5，1 pg/mg)，内标添加终浓度为0.2 pg/mg。 用浓醋酸将碱性溶液调整 pH至4。经过涡流混合振荡后，加入4毫升正己烷：乙酸乙酯(9：1)溶液于THCCOOH 酸性溶液中液液萃取。干燥萃取液后加入50 uL PFPA 和 25 uL HFIP 在70℃进行衍生处理，加入50 uL 己烷复溶。取 2 pL，用 GC-MS 方法在 NCI 模式下对 THCCOOH 进行测定。 为便于全面了解方法开发和验证过程，样品制备、采集和分析的情况详述如下。对于任何分析方法，须用毛发样品进行充分验证。 分析使用的仪器系统为 Thermo ScientificTM配置了 TriPlus'M RSH 液相自动进样器 TSQIM9000三重四极杆 GC-MS/MS 系统。使用 Thermo ScientificMTraceFinderM软件进行数据采集和处理。该系统还配备了分流/不分流进样口，使用单锥不分流石英棉衬管(P/N453A1925)。色谱柱为 Thermo ScientificMTraceGOLDTM TG-5MS柱，尺寸为：20mx0.18mm×0.18 um (P/N 26098-5780)。 载气为为气，恒流模式，流速1.0 mL/min。 TRACE1310 GC 系统的初始温度为150℃(1min)后，柱温箱立即以20 ℃/min 升温速率升温至310℃，保持4 min。。总运行时间为 13 min。 保留时间(min) 电离模式 母离子(m/z) 子离子(m/z) 碰撞能(eV) THCCOOH-d3 6.52 负 623 386.2 10 THCCOOH-d3 6.52 负 623 534.3 12 THCCOOH 6.53 负 620 383.2 10 THCCOOH 6.53 负 620 531.3 12 图 2. THCCOOH 的工作曲线。每个标样进样五次。 传输线温度为250℃。分流/不分流进样口温度为280℃。进样体积为2pL， 不分流模式进样 1 min。TSQ 9000GC-MS/MS 系统中，离子源温度为200℃，质谱仪用AutoTuneTM NCI 参数进行调谐。以2 mL/min 的甲烷气做反应气。优化后的离子对质量和碰撞能见表2。 所有标样都是通过在空白人体毛发样品中添加 THCCOOH和 THCCOOH-d3 标品后按文中所述样品制备方法进行处理后制备。对每个校准标样进行五次平行分析。TSQ9000 GC-MS/MS 系统提供了极佳的定量结果，使用内标的工作曲线在 0.05-1 pg/mg 浓度范围内线性良好，?>0.996(图2和图3)。 通过比较 0.05 pg/mg标样和无药空白基质样品(图4)考察了 THCCOOH 的基质干扰情况，未发现基质干扰现象。 图5所示，下THCCOOH 在 0.05 pg/mg 浓度的定量离子、确证离子，以及定量离子与确证离子的叠加离子图。 以 0.05 pg/mg 标品的基质样品进行五次平行分析测定LOD。TraceFinder 软件使用t检验方法，在99%的置信区间内自动计算出 LOD，结果为 0.022 pg/mg(表3)。 图 4.最低加标基质样品与基质空白对比图。 Quan Peak 表3. 0.05 pg/mg加标样品5次分析的重现性和 LOD。 峰面积 响应因子/比值 计算浓度 (pg/mg) 0_05ppb05 4905 0.042 0.043 0_05ppb04 5066 0.043 0.044 0_05ppb03 5419 0.047 0.053 0_05ppb02 4716 0.044 0.046 0_05ppb01 5173 0.048 0.056 均值 5056 0.045 0.049 标准偏差 267 0.0026 0.0057 RSD% 5.3 5.8 11.9 图5.0.05 pg/mg样品中的定量离子图、确证离子图、及叠加离子图。 化合物 平均浓度 标准偏差 t-检验 %RSD LOD THCCOOH 0.049 0.0057 3.75 11.9 0.022 结论 本研究的结果表明，TSQ 9000 GC-MS/MS 系统与Trace Finder 软件相结合，建立了毛发样品中 THCCOOH常规分析的有效、可靠的方法。TraceFinder 软件提供了“一站式”工作流程，分析人员可以轻松地建立编辑方法、检测样品、检测结果和生成报告。 此外，基于真空锁(VPI)功能，使用者可实现2分钟以内，不泄真空的情况下对 TSQ 9000 GC-MS/MS 系统进行CI和EI模式快速切换。日由于在毒理学实验室中许多分析方法间需要El和CI两种模式切换 TSQ 9000GC-MS/MS系统将带来高效工作效率。 本文所述的分析方法同时可对 THCCOOH 的准确定量，能满足 0.05 pg/mg 的极低检出要求。 TSQ 9000 keep aline with MS/MS 系统，不仅具备卓越的性能满足分析需求，同时具备易用性和杰出的分析速度。分析结果表明，在0.05 pg/mg 到 1.00 pg/mg的工作曲线范围内，本方法都呈现出良好的线性。 ( 1.D.Wilkins，H.Haughey，E.Cone，M.Huestis，R.Foltz，D.Rollins.Quantitative analysis of THC，11-OH-THC，and THCCOOH in human hair by negativeion chemical ionization mass spectrometry，J.Anal. T oxicol.19，1995.483-491. ) ( 2.H.Sachs，U.Dressler，Detection of THCCOOH in hairby MSD-NCI after HPLC cleanup，Fo r ensic Sci. lnt.107，2000，239-247. ) ( 3. C.Moore，F.Guzaldo，T.Donahue.The determination of 11-nor-delta 9 -四氢大麻酚-9-carboxylic acid (THCCOOH) in h air using negative ion gaschromatography-mass spectrometry and high-volumeinjection，J.Anal.Toxicol.25，2001.555-558. ) ( 4. M.J.Baptista，P.V.Monsanto，E.G.Pinho Marques，A.Bermejo，S.Avila，A.M.Castanheira，C.Margalho，M. Barroso，D.N.Vieira，Hair analysis for delta (9) -THC，delta (9)-THCCOOH，CBN and CBD，by GC/MS-EI. Comparison with GC/MS-NCI for [8]M.A.Huestis，et al.Cannabinoid concentrations in h air from documented 大麻 users，Forensic Sci.Int.169，2007，129-136. ) ( 5. R.L.Foltz，K.M.McGinnis，D.M.Chinn，Quantitative measurement of delta 9-四氢大麻酚 and two major metabolites i n physiological specimens usingcapillary column gas chromatography negative ion ) ( chemical ionization mass spectrometry，Biomed.MassSpectrom.10，1983，316-323. ) ( 6. W.A.Baumgartner，V.A.Hill， W.H.Blahd.Hair analysis fordrugs of abuse，J.Forensic Sci.34，1989，1433-1453. ) ( 7. V.Cirimele，P.Kintz，P.Mangin，Testing human hair for 大麻，Fo r ensic Sci.Int.70，1995，175-182. ) ( 8. Quintela，O.； Bermejo，A.M.； Tabernero，M.J.； Strano-Rossi，S.； Chiarotti，M.； Lucas，A.C.Evaluation of cocaine，amphetamines and 大麻 use in university students through hair analysis： preliminary results.Forensic Sc i . lnt.2000，10 7 (1-3)，273-279. ) ( 9.Schwarzhoff，R.； Cody，J.T.Effects of adultering agentson FPIA a n alysis of urine f o r drugs of abuse.J.Anal. Toxicol.1993，1 7 (1 ) ，14-17. ) ( 10.Huestis， M.A.； Mitchell， J.M.； Cone， E.J。 L oweringthe federally mandated cannabinoid immunoassay cut-off increases true positive results.Clin.Chem.1994， 40 (5)，729-733. ) 对其代谢物的检测则可区分故意吸食 （有效的毒 品吸食）与被动污染。大麻在体内的主要代谢产物是 11-羟基四氢大麻 酚 （THC-OH） 和 THCCOOH。考虑到外部污染的可能，SAMHSA 已 在推荐指导方针中将毛发中大麻的筛查检出限浓度值设为 pg/mg，并把 THCCOH 的确证限浓度值设为 0.05 pg/mg2–5 （表 1）。