泡腾片中维生素 C（L-抗坏血酸）检测方案(紫外分光光度)

专用于UV-Vis 测量的多通道流通池蠕动泵的优势 蠕动泵与手动比色皿测量相比，可节省分析时间并改善测量精度 Wesam Alwan 博士安捷伦科技有限公司 提高在实验室中执行常规测量的分析系统通量，可节省时间和经费。但是，提高通量不得影响分析准确度或精密度。考虑使用紫外-可见分光光度计的效率时，如果手动填充、取放和清洁比色皿，样品处理通常是主要的限速步骤。 本研究对蠕动泵(用于将液体样品泵送通过分光光度计中的流通池)的使用与手动测量进行了比较。附件 Cary Sipper 蠕动泵可通过分光光度计的软件进行控制，从而集成为分析方法的一部分。 Cary Sipper 蠕动泵的独特之处在于有三个通道，，可将三个液体样品同步泵入紫外-可见分光光度计中。它能完美配合 Cary 3500 紫外-可见分光光度计的同步测量功能，从而增强了样品自动化处理的明显优势。 使用常见的分析应用，即市售泡腾片中维生素C(L-抗坏血酸)的定量分析，进行了两种方法的比较研究。 标样前处理 L-抗坏血酸储备液配制：在23.5℃下将50.0mg纯L-抗坏血酸溶于 100 mL 0.1 mol/L HCI中， 得到 pH 为 1.5的 500 mg/L储备液。然后用 0.1 mol/L HCI稀释储备液，制得浓度在0-70 mg/L 之间的八种标样，如表1所示。这些标样涵盖约0-4个吸光度单位的吸光度范围，该范围代表了常规扫描紫外-可见分光光度计的典型范围。所有测量(使用和不用 CarySipper蠕动泵)采用相同的标准溶液。 表1.配制的标样浓度及其平均吸光度(n=3) 标样ID 浓度(mg/L) 吸光度 标样1 0 0.0014 标样2 10 0.5893 标样3 20 1.1584 标样4 30 1.7088 标样5 40 2.2768 标样6 50 2.8228 标样7 60 3.4147 标样8 70 3.9120 样品前处理 市售泡腾维生素C片购自当地药房。标签表明，每片含1000mg 维生素C。记录20片中每片的重量(表2)，然后用研钵和研杵碾成粉末。对于每个样品，取5.5-28.0 mg 之间的不同量粉末。将粉末溶于 100 mL 经 Milli-Q 过滤的水中，并在23.5℃下将其 pH 调节至1.5。由此制得20个样品，校准范围为 0-70 mg/L。所有测量量(使用和不用 Cary Sipper 蠕动泵)采用相同的样品溶液。 假设每片包含1000 mg 维生素C，按照产品标签，计算每种样品溶液中的维生素C含量。该计算基于每片的重量和制备各种样品溶液的研磨片剂粉末所用的重量。还计算了各种样品溶液的最终浓度。两种计算值列于表2中。 样品编号 片剂重量(mg) 取用的量(mg) 样品溶液中的 维生素C计算含量(mg) 样品溶液中的 维生素C计算含量(mg/L) 1. 4209 16.6 3.9 39.4 2. 4253 19.0 4.5 44.7 3. 4239 28.0 6.6 66.1 4. 4212 11.9 2.8 28.3 5. 4247 5.5 1.3 13.0 6. 4239 18.0 4.2 42.5 7. 4238 22.1 5.2 52.1 8. 4231 16.5 3.9 39.0 9. 4242 28.0 6.6 66.0 10. 4201 7.5 1.8 17.9 11. 4219 18.4 4.4 43.6 12. 4229 18.0 4.3 42.6 13. 4214 6.5 1.5 15.4 14. 4219 24.0 5.7 56.9 15. 4261 20.8 4.9 48.8 16. 4209 13.8 3.3 32.8 17. 4234 15.0 3.5 35.4 18. 4241 13.0 3.1 30.7 19. 4268 17.6 4.1 41.2 20. 4229 8.0 1.9 18.9 仪器 本研究采用 Agilent Cary 3500 多池紫外-可见分光光度计。Cary 3500 仪器的这一配置最多可同时测量八个比色皿位置(七个样品和一个参比)。对于其中一半的测量，仪器配备Cary Sipper蠕动泵(参见图1)，该蠕动泵可同步泵送三种样品溶液通过位于仪器样品室内部的三个流通池。在另一半测量中，手动转移至比色皿中，然后转移至分光光度计中。 图1.连接至 Cary 3500 多池紫外-可见分光光度计的 Cary Sipper 蠕动泵附件 将蠕动泵入口管插入包含待分析溶液的15mL Falcon 管中，进行蠕动泵测量。然后将溶液泵入单个10 mm 光程的 390 uL 石英流通池中。在两次扫描之间，使用 Milli-Q水冲洗流动池，以免交叉污染。将每个标样和样品重复测量三次。 Cary Sipper 蠕动泵在 80 rpm 的固定转速下运行。在测量之前将溶液泵送到流通池中所需的时间称为“填充”时间。随后的无泵送时间段(使溶液静置去除气泡及颗粒干扰)称为“保持”时间。最后设定蠕动泵将冲洗溶液泵送通过流通池的持续时间，称为“冲洗”时间。所有这三个时间均在 Cary UV 工作站软件中进行设置，并可以另存为已存储方法的一部分。 图 2. Cary UV 工作站软件内 Cary Sipper 蠕动泵附件的控制 对于另一半测量，使用标准10 mm 光程的3.5mL 石英比色皿。每次测量后，用样品溶液手动填充这些比色皿，并用Milli-Q水进行冲洗。将每个标样和样品重复测量三次。 在两种仪器设置下，使用相同的标样和样品溶液，以便直接比较结果 使用 Cary UV工作站软件中的“浓度”应用程序进行测量。该应用程序提供了一种创建校准曲线并基于校准曲线确定样品浓度的方法。 每个标样和样品的波长扫描。((使用表3中列出的参数)在350-200 nm 之间进行。样品经过 0.1 mol/L HCI 的基线校正。利用243 nm 下的峰进行定量分析。然后利用各种标样的吸光度值创建校准曲线。使用相同的仪器参数测量样品，并对每个样品中的维生素C含量进行定量分析。 图3.每个标准溶液的波长扫描。利用243nm 下的吸光度创建校准曲线，随后进行样品定量分析 由于使用 Cary Sipper 蠕动泵可能快于手动填充比色皿，因此执行一系列测量以量化节省的时间。用四种不同的方式测量30个溶液(10个标样和20个样品)： 1.不用蠕动泵，使用单个 3.5mL 比色皿。每次测量时手动填充、清空和冲洗比色皿 2. 不用蠕动泵，使用三个标准 3.5 mL 比色皿。每次测量时手动填充、清空和冲洗比色皿。使用 Cary 3500多池仪器的同步测量功能，同步测量所有三个比色皿 3. 用蠕动泵泵送至单个流通池 4. 用蠕动泵泵送至三个流通池 使用表4所示的仪器参数进行测量。 表3.用于定量测量的仪器参数 参数 设置 波长范围(nm) 200-350 光谱带宽(nm) 1 平均时间(s) 0.1 数据间隔(nm) 1 流通池体积(pL) 390 填充时间 (s) 30 保持时间 (s) 10 冲洗时间 (s) 30 表4.用于分析速度比较测量的仪器参数 参数 设置 波长范围(nm) 200-350 光谱带宽(nm) 1 平均时间(s) 0.1 数据间隔(nm) 1 流通池体积(pL) 390 填充时间(s) 15 保持时间 (s) 5 冲洗时间(s) 15 校准线性 使用 Cary Sipper 蠕动泵由八个标样生成校准曲线的R²值为0.9997， 而通过比色皿测量生成曲线的R²值为0.9998。 Cary3500 具有超过 3 Abs 的优异光度测量线性，能够测量高浓度液体样品并获得准确的光度测量结果。 图4.使用手动填充的石英比色皿生成的校准曲线 图5.使用 Cary Sipper 蠕动泵生成的校准曲线 测量精度 在两种仪器设置下，对20个样品溶液分别测量3次。使用Cary Sipper蠕动泵时，将样品溶液泵入流通池中，进行测量，然后替换为冲洗溶液，最后再次用相同的样品溶液填充流通池。对于20个样品中的每个样品，将该过程重复3次。使用3.5 mL比色皿时，用样品填充比色皿，进行测量，冲洗，然后用另一份相同的样品重新填充。对于20个样品中的每个样品，将该过程重复3次。 如表5所示，两组结果均具有很高的精密度， %RSD 值远低于药典方法中通常规定2%的要求。所有六次测量结果的 %RSD为0.1869%。 表5.由20个样品测量得到的吸光度数据，其中每个样品在各种仪器设置下测量3次最后一列%RSD 是所有六次测量结果的精密度。 表6.使用两种仪器设置计算出的各样品浓度。由样品浓度计算每片中维生素C的含量，并将其与标示的每片1000 mg 的标签值进行比较(%差值) 利用蠕动泵得到的测量值 利用手动比色皿得到的测量值 %RSDn=6 样品 平均值(n=3)(Abs) %RSD 平均值(n=3)(Abs) %RSD 1 2.2091 0.0775 2.2153 0.0197 0.1470 2 2.4895 0.3394 2.4763 0.0400 0.3313 3 3.8029 0.0462 3.7888 0.1150 0.1988 4 1.5972 0.1706 1.5912 0.0142 0.2119 5 0.7646 0.0991 0.7666 0.0190 0.1435 6 2.4438 0.0372 2.4353 0.0398 0.1766 7 3.0153 0.1773 3.0050 0.0315 0.1997 8 2.1405 0.2443 2.1333 0.0921 0.2277 9 3.6846 0.1805 3.6816 0.0161 0.1121 10 1.0538 0.1516 1.0581 0.0394 0.2241 11 2.4493 0.2714 2.4367 0.0441 0.3037 12 2.4525 0.2948 2.4351 0.0256 0.3941 13 0.8735 0.1588 0.8722 0.0330 0.1209 14 3.1695 0.2032 3.1676 0.0525 0.1248 15 2.7457 0.1754 2.7409 0.0389 0.1364 16 1.7695 0.2143 1.7631 0.0086 0.2186 17 2.0182 0.1966 2.0190 0.0207 0.1160 18 1.7909 0.1568 1.7863 0.1621 0.1818 19 2.3171 0.0425 2.3193 0.0129 0.0539 20 1.1099 0.0229 1.1098 0.1987 0.1157 蠕动泵设置 比色皿设置 样品编号 实测浓度(mg/L) 维生素C计算含量(mg) 计算值与标签值之差(%) 实测浓度(mg/L) 维生素C计算含量(mg) 计算值与标签值之差(%) 1 39.00 988.9 1.1 39.12 991.9 0.8 2 44.01 985.1 1.5 43.78 980.0 2.0 3 67.46 1021.3 2.1 67.22 1017.6 1.7 4 28.07 993.6 0.6 27.97 990.2 1.0 5 13.21 1019.7 1.9 13.25 1023.2 2.3 6 43.19 1017.2 1.7 43.05 1013.8 1.4 7 53.40 1023.9 2.3 53.22 1020.6 2.0 8 37.78 968.7 3.2 37.65 965.6 3.6 9 65.35 990.0 1.0 65.30 989.4 1.1 10 18.37 1028.9 2.8 18.46 1033.8 3.3 11 43.29 992.6 0.7 43.07 987.6 1.3 12 43.35 1018.4 1.8 43.05 1011.3 1.1 13 15.15 982.2 1.8 15.13 981.2 1.9 14 56.15 987.1 1.3 56.12 986.6 1.4 15 48.58 995.2 0.5 48.51 993.7 0.6 16 31.15 950.1 5.3 31.05 946.9 5.6 17 35.59 1004.6 0.5 35.62 1005.3 0.5 18 31.53 1028.7 2.8 31.46 1026.3 2.6 19 40.93 992.5 0.8 40.98 993.7 0.6 20 19.37 1024.1 2.4 19.38 1024.4 2.4 样品定量分析 根据比尔-朗伯定律，用每个样品三个吸光度读数的平均值和校准曲线确定每个样品溶液中维生素C的浓度。然后利用该浓度计算所测量的各片中维生素C的重量。结果如表6所示。使用蠕动泵设置计算出的重量与标示重量之间的平均偏差为1.8%，偏差范围为0.5%-5.3%。使用比色皿测得的相同20个样品的平均偏差为1.9%，偏差范围为 0.6%-5.6%。结果完全符合 USP 中规定的±10%可接受标准，表明该片剂符合其标签要求。 测量时间 与手动填充比色皿相比， Cary Sipper 蠕动泵可节省大量时间。如表7所示，与使用单个标准比色皿逐个测量样品相比，使用带3个流通池的蠕动泵将测量30个样品的时间缩短了65%。在不使用蠕动泵的情况下，与对单个比色皿进行三次填充、排空和重新填充相比，同时测量三个比色皿可节省24%的时间。与在 Cary 3500 多池仪器中同时手动使用三个比色皿相比，使用蠕动泵与三个流通池可以使测量速度加快54%。 表7.采用四种不同仪器设置测量30个样品所需的时间 操作模式 测量时间 n=30 时间缩短(%) (与采用单个比色皿的手动处理相比) 手动比色皿处理 1.双池模块 (1什样品比色皿) 21 min 30 s 2.多池模块 (3个样品比色皿) 16 min 26 s 24% 使用蠕动泵 填充时间(15s)， 保持时间(5s)， 冲洗时间 (15s) 3.1个流通池 19 min 32 s 9% 4.3个流通池 7 min 30s 65% ( 本研究对使用 Cary Sipper 蠕动泵泵送溶液以在紫外-可见分光光度计中进行测量与手动填充和排空标准比色皿进行了比较。结果证明，蠕动泵与手动测量的精度相当，且测量速度加快 65%. ) ( 使用两种不同设置测得的样品吸光度非常一致。所有六次测量 结果的%RSD 为 0.1869，表明该方法的精密度很高。 ) ( 当使用 Cary 3500 紫外-可见分光光度计的同步测量功能同步测量三个标准比色皿样品时，比逐个测量三个样品的速度加快 了24%。 ) ( 蠕动泵设置通过仪器软件进行控制，并可作为仪器方法的一部分进行存储。这样可以确保在分析中采用一致的设置。 ) 结果证明， 配备 Cary Sipper 蠕动泵的 Cary 3500紫外-可见分光光度计是常规测量多个液体样品的理想仪器。它提供了更快的分析速度，并在工作流程中节省了大量的时间。 Cary 3500具有宽吸光度范围，可减少对样品稀释的需要，与使用比色皿手动测量样品相比，可提供更高的精密度和准确度。 ( 参考文献 ) ( 1. D ietary Supplements Compendium， 2019， UnitedStates Pharmacopeia， US Government Printing Office：Washington， DC， 2019 ) 查找当地的安捷伦客户中心：www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278， 400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价：www.agilent.com/chem/erfq-cn 本研究对使用 Cary Sipper 蠕动泵泵送溶液以在紫外-可见分光光度计中进行测量与手动填充和排空标准比色皿进行了比较。结果证明，蠕动泵与手动测量的精度相当，且测量速度加快65%。使用两种不同设置测得的样品吸光度非常一致。所有六次测量结果的 %RSD 为 0.1869，表明该方法的精密度很高。当使用 Cary 3500 紫外-可见分光光度计的同步测量功能同步测量三个标准比色皿样品时，比逐个测量三个样品的速度加快了 24%。蠕动泵设置通过仪器软件进行控制，并可作为仪器方法的一部分进行存储。这样可以确保在分析中采用一致的设置。结果证明，配备 Cary Sipper 蠕动泵的 Cary 3500 紫外-可见分光光度计是常规测量多个液体样品的理想仪器。它提供了更快的分析速度，并在工作流程中节省了大量的时间。Cary 3500具有宽吸光度范围，可减少对样品稀释的需要，与使用比色皿手动测量样品相比，可提供更高的精密度和准确度。