沙坦类药物中N-亚硝基二甲胺和 N-亚硝基二乙胺检测方案(自动进样器)

使用 Agilent 7697A 顶空进样器和8890/5977 GC/MSD 系统分析N-亚硝基二甲胺和N-亚硝基二乙胺 根据 US FDA 指南对沙坦类药物进行杂质分析 作者 摘要 Abbey Fausett安捷伦科技有限公司 本应用简报介绍了根据美国食品药品监督管理局(US FDA) 的方法，使用 Agilent8890 气相色谱仪对沙坦类药物进行杂质分析。在工作流程中还使用了 Agilent 7697A顶空进样器和5977 GC/MSD。分析结果与预期检测值相符。 据世界卫生组织报道，25岁以上的成年人中，有35%-46%的人患有高血压。这种疾病困扰着全球超过10亿人口2。缬沙坦、氯沙坦和其他血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂 (ARB)是治疗高血压的常用药物，它们在全球均有销售，并且相对便宜。ARB 的作用机制是通过抑制血管紧张素Ⅱ与其受体的结合过程，防止血管收缩，从而有效降低血压3。 2018年7月，缬沙坦因存在污染风险，被宣布在全球范围内召回。最初鉴定出的污染物为N-亚硝基二甲胺(NDMA)。US FDA 发布了一项程序，用于指导生产实验室在销售前对缬沙坦产品中可能致癌的杂质进行筛查4。在召回后不久又鉴定出了第二种污染物 N-亚硝基二乙胺(NDEA)，并得到了欧洲药品管理局的确认同。与NDMA 一样，N-亚硝基二乙胺也被列为可能的致癌物质，并认为是沙坦类药物常见的四唑环合成过程中生成的次级产物。随着新杂质的确认并鉴于其与四唑环的关系，将最初的召回范围扩大到了生产中的所有沙坦类药物。根据欧洲药品管理局的报告， US FDA 制定了后续的监管程序，旨在通过使用单一方法处理以上两种污染物。方法中所做的修改包括改变前处理溶剂以及使用不同的气相色谱柱固定相同。该方法文件于2019年1月发布，其中采用配备顶空进样的 GC/MS 对原料 药和成品进行分析，并规定了 NDMA 和NDEA 的定量限 (LOQ) 分别为 0.10 ppm和0.05 ppm。虽然 FDA 的程序是在Agilent 7890A 气相色谱系统上执行的，但本应用简报表明， Agilent 8890 气相色谱系统具有与7890系统同样出色的性能。 纯 NDMA和NDEA标准品通过 MilliporeSigma (Burlington， MA， USA) 购买。FDA 指南161要求使用纯度不低于99.0%的1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。但在所提供的条件下，如果使用更高纯度的溶剂 (99.7%，MilliporeSigma)，能够提高目标化合物与溶剂杂质的分离度。由于该分析的适用范围覆盖了全球其他监管机构，因此如果在样品前处理过程中采用纯度较低的溶剂，为了实现更好的分离，在色谱参数方面可能会有所不同。本评估过程中包含的所有数据与 FDA 方案一致，没有任何偏差。 方法条件汇总于下表中。虽然此项工作在快速 GC 柱温箱(240V)上完成，但其并非获得所需结果的必要条件。在顶空方法开发过程中，另一个有用的选件是顶空传输线附件，它能够在不改变配置的前提下，在相同的进样口中实现顶空和液体进样功能。表1列出了分析中所用的消耗品。根据 FDA 指南配制校准溶液，并增加了一份浓度为1 pg/mL 的校准溶液。 方法条件 Agilent 7697A 顶空进样器条件 柱温箱温度 130°℃ 定量环温度 180°C 传输线温度 185℃ 样品瓶平衡时间 15分钟 进样持续时间 1分钟 样品瓶规格(mL) 20 mL 样品瓶振荡 5级 填充模式 默认 填充压力 15 psi 定量环填充模式 默认 Agilent 8890 气相色谱参数 进样口(分流/不分流) 氦气 温度 220°C 模式 分流 分流比 5：1 进样口压力(初始) 7.33 psi 柱温箱类型 240V快速升温柱温箱 平衡时间 1分钟 柱温箱升温程序 40℃保持0.5分钟， 以20C/min 升至160°℃， 以10°℃/min 升至240℃，保持2分钟 总运行时间： 16.5分钟 色谱柱 Agilent J&W DB-1701，30m×250 pm， 1.0 pm 模式 恒流 流速 1 mL/min Agilent 5977 GC/MSD 条件 Agilent 5977 GC/MSD 条件 离子源类型 Extractor 离子源温度 230°C 质量过滤器模式 选择离子监测 (SIM) NDMAm/Z 74.00 NDEAm/z 102 透镜直径 6 mm 四极杆温度 150℃ NDMA驻留 150 NDEA驻留 150 表1.分析所用的消耗品 描述 部件号 顶空样品瓶(20mL) 5182-0837 样品瓶盖 5183-4477 气相色谱衬管 5190-2295 气相色谱隔垫 5183-4759 色谱普DB-1701 122-0733 提取透镜(6mm) G3870-20448 该方法实现了出色的分离度，目标峰与溶剂和基质峰充分分离。图1为色谱图示例。 保留时间与 FDA 法规所提供的数据一致。图2A和2B所示为 NDMA 和 NDEA在三个最低校准点(0.025、0.05和0.1pg)的叠加谱图。 图1.选择离子监测模式下 NMP 中 1 ug NDMA 和 NDEA 混标生成的谱图。 NDMA 保留时间为5.80分钟， NDEA保留时间为7.25分钟 图2.NDMA (A)和 NDEA (B) 在三个最低校准点的重叠谱图 使用 Agilent MassHunter 定量分析软件生成了两条校准曲线。由于是采用校准曲线的低浓度端进行 LOQ 和检测限(LOD)研究，因此根据 0.025 pg 和 0.5 pg范围内的校准曲线对定量结果进行了处理。在0.025-100 pg 的整个曲线范围内，逆向加权线性相关系数大于0.995。图3A和3B所示为本仪器获得的低浓度校准曲线信息。通过记录色谱柱上信噪比不低于3：1的最小进样量来确定 LOD。在NDMA和 NDEA 的校准中，最低浓度点0.025 pg 超出了此设定值。 生成每种化合物的校准曲线后，在曲线范围内对三个浓度水平下的五份重复标样进行了分析。表2汇总了重现性评估的结果。 通过对基质进行加标回收率测试，对方法性能进行了最终评估。针对所引用的LOQ，将两个最低浓度的校准标样加标至一式三份的样品瓶中，每个样品瓶中含有500 mg 已溶解的缬沙坦药片。该批次样品的分析结果表明，在加标回收率测试之前，未检出 NDMA 和 NDEA 化合物。 表3提供了测量结果 标样含量 测得的含量 图3.根据校准曲线进行处理后，低浓度校准范围内的线性回归结果和校准标样分析结果的准确度 表2.标样的重现性统计结果(n=5) 0.025 pg标样 0.05 pg标样 0.1 pg标样 NDMA NDEA NDMA NDEA NDMA NDEA 测得的平均含量 0.0249 0.0248 0.0518 0.0506 0.1012 0.0988 %RSD 4.95 2.89 6.24 0.7 2.65 4.07 表3.由NDMA 和 NDEA目标化合物的三个平行样品获得的 LOQ测定结果 目标LOQ 平均回收率 平均回收率 1ppm 0.05 ppm 0.10 ppm NDMA 0.10 0.056 0.11 NDEA 0.05 0.057 0.11 Agilent 8890 气相色谱仪延续了进行药品安全筛查所必需的稳定性和重现性。8890气相色谱仪与 Agilent 7697A 顶空进样器和 Agilent 5977 GC/MSD 配合使用时，符合FDA 指令的要求，并且获得的结果与沙坦类药物中主要杂质分析的预期检测值相符。 ( 1. G lobal Health Observatory (GHO)data. https：//www.who.int/gho/ncd/risk_factors/blood_pressure_ prevalenc e _text/en/-2019年6月17日查阅 ) 2. http：//www.bloodpressureuk.org/mediacentre/Newsreleases/1billionpeopleworldwidenowhavehighbloodpressure 3. Barreras， A.； Gurk-Turner， C. Angiotensin II Receptor Blockers.Proc (Bay/ Univ Med Cent) 2003，16(1)，123-126. doi：10.1080/089982 80.2003.11927893 4， GC/MS Headspace Method for Detection of NDMA in Valsartan DrugSubstance and Drug Products. U.S.Food and Drug Administration， FY18-176-DPA-S 5. European Medicines Agency Reportof NDEA 6. Combined N-Nitrosodimethylamine(NDMA) and N-Nitrosodiethylamine(NDEA) Impurity Assay by GC/MSHeadspace.U.S. Food and DrugAdministration，FY19-005-DPA-S 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线：800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com ( 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ) ( 5994-1132ZHCN ) Agilent 8890 气相色谱仪延续了进行药品安全筛查所必需的稳定性和重现性。8890 气相色谱仪与 Agilent 7697A 顶空进样器和 Agilent 5977 GC/MSD 配合使用时，符合 FDA 指令的要求，并且获得的结果与沙坦类药物中主要杂质分析的预期检测值相符。