食品样品（多种水果和蔬菜）中农药残留检测方案(气相色谱仪)

应用简报 Agilent食品Trusted Answers 应用 GC/MS/MS对食品样品进行快速农药残留分析 Amadeo R. Fernandez-Alba， Samanta Ucles， Elena Hakme 农药残留研究组 水文地质学与分析化学系 阿尔梅里亚大学 西班牙阿尔梅里亚 Joerg Reiner ( 安捷伦科技有限公司 ) 德国瓦尔德布隆 本应用简报介绍了使用Agilent Intuvo 9000 气相色谱系统和 Agilent 7010B 三重四极杆质谱仪对多种水果和蔬菜进行12.4分钟快速多残留农药分析方法的评估与验证，还介绍了该方法在标准物质和常规样品中的应用。203种目标化合物是 EURL (欧盟参考实验室)推荐用于水果和蔬菜 GC/MS 分析的主要农药。各种水果和蔬菜均达到了2 pg/kg 的定量限(LOQ)，获得了灵敏度令人满意结果。由于该方法采用直接加热气相色谱技术，确保色谱分离能力和日常操作稳定性保持较高水平，大大提升了分析速度。该方法能够提高样品通量，为控制实验室带来了巨大优势。 快速气相色谱 (GC) 方法受到越来越多的关注。实验室正在寻找缩短分析时间以提高样品通量、降低分析成本，同时又不影响结果的方法。多数气相色谱系统中使用的经典型传统柱温箱首先加热柱温箱内的空气，然后将热量传递到气相色谱柱。该方法的运行时间通常为20-41分钟。具有盘式色谱柱设计的 Intuvo 9000 气相色谱仪采用有效的直接接触式传导加热，可通过出色的控制获得更快的热梯度这意味着柱温箱可以更快冷却，且系统功耗不到传统空气浴柱温箱的一半。 最近发表的一篇论文中报道了开发项目的结果，重点研究了基于 Intuvo 的 GC/MS分析关键农药的不同速度设置。该论文的结论是，只需12.4分钟的运行时间即可获得令人满意的控制工作数据。本应用简报重点讨论这一12.4分钟的方法，列出了三种食品基质(苹果、橙子、番茄)中浓度分别为2、10、50 pg/kg 的203种农药在线性、回收率、检测限(LOD)、LOQ、基质效应以及日内和日间精密度等 方面的验证数据。 多反应监测 (dMRM) 而非时间段进行分析。每种分析物设置两个离子对，保留时间窗口范围为0.2分钟。 dMRM功能可根据方法中任何给定时间下所需的离子对数量，自动调整驻留时间。表2列出了本研究中涵盖的化合物以及每种分析物的两个离子对、碰撞能量和保留时间。 表1.9000 Intuvo GC 和 7010B GC/TQ仪器条件 参数 值 9000 Intuvo GC 惰性流路配置 柱中反吹芯片(部件号 G4588-60721) 进样针 10 pL (部件号 G4513-80204) 溶剂清洗 进样前： 2次溶剂A，乙酸乙酯(8pL) 2次溶剂B， 乙酸乙酯(8pL) 进样后： 4次溶剂A， 乙酸乙乙(8pL) 4次溶剂B， 乙酸乙酯(8pL) 样品清洗 1×1pL 样品抽吸次数 6 载气 氦气 进样口 多模式进样器(MMI)，脉冲不分流模式，300℃ 分流出口吹扫流速 60 mL/min (0.75 min 时) 隔垫吹扫流速 2 mL/min，切换 载气节省 20 mL/min (3 min 后) Intuvo 芯片式保护柱 炉温跟踪 色谱柱 2 根 Agilent J&W HP-5ms 超高性性色谱柱 (15mx0.25 mm 内径， 0.25 pm 膜厚度，部件号19091S-431UI-INT) 色谱柱流速 色谱柱1：1.611 mL/min 色谱柱2：1.811 mL/min 柱温程序 80℃初始温度 以 20°C/min 升至 170℃ 以 20℃/min 升至 310 ℃ (3.5 min) 7010B 系列三重四极杆 GC/MS 传输线温度 280°C 离子源温度 280°C 四极杆温度 150°℃ 溶剂延迟 3.1 min 调谐文件 atunes.eihs.tune 采集方法 每个分析物两个离子对，动态MRM (时间窗口0.2分钟) 表2.所分析的化合物列表及其相应采集参数(保留时间、离子对和碰撞能量) 化合物 RT (min) SRM 1 CE1 (V) SRM 2 CE2 (V) 螺甲螨酯 8.451 272→254 3 272→209 12 治螟磷 5.053 238→146 10 202→146 10 硫丙磷 7.894 322→156 10 156→141 15 戊唑醇 8.233 250→153 12 250-125 20 吡螨胺 8.638 333→276 5 333→171 20 四氯硝基苯 4.796 215→179 10 203→143 20 七氟菊酯 5.617 177→137 15 177→127 15 特丁磷 5.505 231→175 10 231-129 25 特丁通 5.391 225→169 3 169→154 5 去草净 6.244 241→185 3 241→170 10 杀虫畏 7.108 329→109 25 329→79 35 氟醚唑 6.517 336→218 30 336-204 30 四氯杀螨砜 8.831 356→229 10 356→159 10 四氢邻苯二甲酰亚胺 4.237 151→122 8 151→80 5 胺菊酯 8.500 164→107 15 164→77 30 禾草丹 6.389 125→89 15 100→72 3 甲基立枯磷 6.096 265→250 15 265→220 25 对甲抑菌灵 6.844 238→137 10 137→91 20 三唑酮 6.503 208→181 5 208→127 15 三唑磷 7.887 161→134 5 161→106 10 肟菌酯 8.003 222→190 3 222→130 15 氟乐灵 4.966 306→264 10 264→160 15 乙烯菌核利 6.02 212→172 15 212→109 40 方法验证 本方法已根据欧盟质量控制程序进行了验证2。评估的分析参数有： 选择性 灵敏度 线性 回收率 重现性 基质效应 日内和日间精密度 利用苹果、橙子、番茄三种不同基质建立三条基质匹配校准曲线，来评估仪器方法的线性。通过加标苹果、橙和番茄的相应空白萃取物制备七个浓度(1、2、5、10、50、100、200 pg/kg)的校准溶液，空白萃取物之前由柠檬酸 QuEChERS萃取制备而成。本文还通过检查 1 pg/kg的最低校准浓度(具有正确的准确性)、检查两个离子对和离子比(<30%)，研究了所有化合物的 LOD。 分别用番茄、苹果和橙子中2和5 pg/kg的两个浓度水平，评估了仪器方法的精密度。每个样品进行五次重复进样。 在五天分别进行2、10、50 ug/kg 的加标实验，以此研究总体方法的日间精密度。 在同一天进行五次加标实验，来研究日内精密度。 将五天加标实验的平均值与分析当天的校准值进行比较，研究了总体方法的准确度。 加标步骤 在35g均质番茄空白样品中加入203种农药标准品。为确保均质化，将样品搅拌30分钟，在室温下静置30分钟后再进行萃取。加标样品分为三部分。最终加标浓度分别为2、10、50 pg/kg。对苹果和橙子基质重复相同步骤。样品前处理的后续步骤适用于每个浓度。 样品前处理 在考虑开发和验证常规气相色谱方法的优点时，应考虑样品前处理时间；否则，加快气相色谱仪分离的优势就不会凸显。采用柠檬酸 QuEChERS 方法A，通过省去净化步骤进一步简化该方法。因此，称量10 g样品置于50 mL PTFE 离心管中。加入10 mL 乙腈。加入10 uL等分试样，其中包括三种程序标准品(敌敌畏-D、马拉硫磷-D1o和磷酸三苯酯)的10 mg/kg 混合物，然后在自动轴向搅拌器中 (AGYTAX，Cirta lab. S.L.， Spain) 振摇离心管4分钟。然后，加入4g硫酸镁、1g氯化钠、1g二水合柠檬酸三钠和0.5 g 半水柠檬酸氢二钠，在自动轴向搅拌器中再次振摇样品4分钟。随后将萃取物在 3500 rpm 下离心5分钟。在进样至气相色谱仪之前，先进行溶剂交换，蒸发50pL 萃取物，然后用50 uL 乙酸乙酯复溶。然后加入林丹-D6进样标准品，浓度为 50 pg/kg。 缩短方法运行时间 之前已经发表了完整研究和优化。已证明 dMRM 是实用工具，因为对不同方法的评估无需不同的 MRM 采集时间段。此举节省了方法开发过程中的大量手动操作。 仪器方法的线性和重现性 所有情况下均获得了良好的线性，残差低于20%，相关系数(R²)高于0.99。所有化合物在浓度高达200 pg/kg (最高检测浓度)时均呈线性。但是，某些农药的线性浓度范围有所不同。番茄样品中分析的99%化合物的线性范围为1-200 pg/kg。邻苯二酚和丁苯丙酸的线性范围较窄，为2-200 pg/kg。异丙酚的线性范围为1-100 ug/kg。对于苹果样品的线性研究，98%化合物的线性范围为1-200 pg/kg。由于喹硫磷、叶菌唑、氟虫腈和环酰菌胺在1 pg/kg 下的准确度较低，其线性范围为2-200ug/kg。氯丹的线性结果介于5-200 pg/kg 之间。由于酸性基质难度较大，橙子样品的图片有所不同。此外，94%的化合物在1-200 pg/kg之间表现出良好的线性。由于化合物灵敏 度的问题，治螟磷、、甲基对氧磷、脱叶亚磷、Mercabam、氯唑磷、氯丹、乙拌磷、乙霉威、马拉氧磷、喹硫磷和密草通表现出较窄的线性范围。乙氧喹是唯一一种线性范围为1-10 pg/kg 的化合物。 在2和5 pg/kg 的重现性评估中，所有化合物和所有基质的 RSD 均<10%。 仪器方法的鉴定限 番茄样品中的所有化合物均可在 1 ug/kg下得到鉴定。两个离子对和良好峰形可证明鉴定结果。在使用研究相关基质研究方法的线性时，还要检查该仪器的限值。 总体方法的日间和日内精密度 对于日间精密度(五天)，所研究化合物中有97%表现出令人满意的结果 (RSD<20%)。某些化合物(如联苯和丁草敌)显示出更高的 RSD 值。对于日内精密度，除联苯、丁草敌、乙菌利和啶斑肟外，所有基质中97%的农药 RSD 均低于20%。苹果样品中的乙菌利和啶斑肟表现出不同的行为。日内精密度研究包括不同的基质，这也正是这两种化合物获得高RSD 的原因。 方法总体准确度 回收率数据显示，在苹果、橙子和番茄样品中，浓度为2、5、10 pg/kg时，97%的化合物在可接受范围内(70%-120%)具有良好的回收率。图1给出了得到的值。 根据欧盟分析质量控制程序，LOQ是回收率和重现性值均令人满意的最低检测浓度。因此，97%化合物的 LOQ 为2 pg/kg，这是经过验证的最低浓度，具有可接受的准确度和精密度。 这对于婴儿食品的分析非常重要，因为婴儿食品具有专门的MRL，通常低于10 pg/kg 的默认 MRL。 实际样品 验证研究完成后，为证明12.4分钟运行时间方法的有效性及其在常规分析中的适用性，将该方法首先应用于 EUPT-FV18(菠菜)和EUPT-FV19(柠檬)样品6。EUPT-FV18样品中适用于气相色谱分析的农药为氟吡菌酰胺、茚虫威和甲霜灵。EUPT-FV18 样品中含有的农药为氟吡菌酰胺、啶酰菌胺、毒死蜱、二嗪磷、氟虫腈、异菌脲和唑菌胺酯。计算了每种化合物的Z分数，结果均可接受。 EUPT-FV18和EUPT-FV19的Z分数分别介于-0.9和+0.1以及-1.49和+0.84之间。 图1.采用运行时间12.4分钟的方法分析苹果、橙子和番茄样品获得的回收率值(A)和 RSD (B) 图2.标准方法(A)与快速 Agilent Intuvo 9000气相色谱方法(B)的比较(由21分钟缩短至12分钟) 使用快速气相色谱程序温度可以将气相色谱分析总时间缩短为2/3，同时不会影响结果质量或方法灵敏度。快速气相色谱方法的主要优势是在保持必需分离的同时提高实验室通量。在大多数情况下，即使浓度低至2 pg/kg，也可获得令人满意的方法验证参数(回收率、重现性、线性和基质效应)。通过分析两个 EUPT-FV样品，评估了该方法的定量准确性。 ( 参考文献 ) Hakme，E.；et al. Furtherimprovements in pesticide residueanalysis in food by applyinggas chromatography triplequadrupole mass spectrometry(GC-QqQ-MS/MS) technologies，Analytical and BioanalyticalChemistry 2018， 410/22，5491-5506，https：//doi.org/10.1007/s00216-017-0723-x 2. European Commission DG-SANTE(2015) Guidance document onanalytical quality control and methodvalidation procedures for pesticidesresidues analysis in food and feed，No SANTE 11945/2015 3. EU pesticides database availableat http：//www.ec.europa.eu 4. Anastassiades， M.； et al.Fast andeasy multiresidue method usingacetonitrile extraction/partitioningand "dispersive solid-phaseextraction" for the determinationof pesticide residues in produce，J. AOAC Int. 2003，86，412-31 5. Mastovska， K.； Hajslova， J.；Lehotay，S.J. Ruggedness and otherperformance characteristics of low-pressure gas chromatography-massspectrometry for the fast analysis ofmultiple pesticide residues in foodcrops. J Chromatogr A. 2004，1054(1-2)，335-49 6. Ferrer， C.； et al. European Unionproficiency tests for pesticideresidues in fruit and vegetablesfrom 2009 to 2016：Overview of theresults and main achievementsFood Control 2017，82，101-113 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 ( C安捷伦科技(中国)有限公司，2019 ) 本应用简报介绍了使用 Agilent Intuvo 9000 气相色谱系统和 Agilent 7010B 三重四极杆质谱仪对多种水果和蔬菜进行 12.4 分钟快速多残留农药分析方法的评估与验证，还介绍了该方法在标准物质和常规样品中的应用。203 种目标化合物是 EURL（欧盟参考实验室）推荐用于水果和蔬菜 GC/MS 分析的主要农药。各种水果和蔬菜均达到了 2 μg/kg 的定量限 (LOQ)，获得了灵敏度令人满意结果。由于该方法采用直接加热气相色谱技术，确保色谱分离能力和日常操作稳定性保持较高水平，大大提升了分析速度。该方法能够提高样品通量，为控制实验室带来了巨大优势。