皮质类固醇样品中色谱检测方案(气相色谱仪)

Zorbax Bonus-RP ---可用于100%水相的色谱柱 方法开发步骤3-7在高pH值下 安捷伦液相色谱柱介绍及选择建议 Agilent Technologies √Zorbax液相色谱柱介绍√Zorbax反相色谱柱选择建议 Agilent Technologies 常规分析柱 Zorbax Eclipse Plus柱 Zorbax Eclipse XDBZorbax Stable Bond 柱 Zorbax Extend C18柱Zorbax Bonus-RP 柱Zorbax SB-Aq 柱 Zorbax RX HPLC 柱原先的Zorbax ODS柱 Zorbax 正相柱 其他Zorbax 柱 生化分析柱 高通量和LC/MS柱 Zorbax 高通量柱， LC/MS HPLC柱 Zorbax 快速分离柱 Zorbax 快速分离高通量柱 Zorbax 溶剂节省色谱柱 Zorbax 微径色谱柱 Zorbax 毛细管柱和纳流柱 Zorbax 300 SB 柱 制备柱 Zorbax PrepHT制备柱 Zorbax 300Extend柱 Zorbax Poroshell柱 Zorbax Eclipse AAA柱 Zorbax GF-250/450 凝胶柱 Zorbax SAX和SCX柱 MARS AgilentR液相色谱柱 安捷伦ZorbaxRHPLC色谱柱 严格的质量控制 产品研究与开发 硅胶生产 键合 柱装填 具可追溯性 ·可定购生产批号不同的色谱柱·特殊规格定制 Agilent Technologies A类硅胶Original ZORBAX SIL (1970s)由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高(硅羟基的pKa低)，导致碱性化合物发生拖尾 类硅胶(高纯)ZORBAX Rx-Sil (1987)由于金属含量低，硅羟基pKa高，碱性化合物不发生拖尾 金属浓度(ppm) 二氧化硅 Na Mg Al Ca Ti Fe Zr Cu Cr Zn Zorbax Rx-SIL 10 <3 4 1.5 2 nd 3 nd nd nd 1 Zorbax SIL 17 nd nd 57 9 32 21 88 <1 nd 88 Nucleosil 56 NZAI N/A nd 130 57 76 nd INZAI N/A nd Hypersil 2900 N/A 40 300 38 65 230 INZAI N/A N/AI N/A nd=未检出 选择适用于pH7.5流动相的色谱柱 Agilent Technologies Zorbax液相色谱柱硅胶特点 Zorbax硅胶的制备方法由液相色谱柱著名创始人J.J. Kirkland发明，属于安捷伦公司的专利技术。 ·高纯度硅胶游离硅羟基活性降低提供更好的峰形·专利的硅珠堆砌法更好的重现性填料颗粒更好的强度提供不同粒径的颗粒 Agilent Technologies Zorbax液相色谱柱硅胶特点专利的硅珠堆砌技术 纯度，强度，对孔径与粒度严格控制――优级ZORBAX键合相基础 ZORBAX Rx多孔硅胶微球 安捷伦拥有此项填料专利技术 Group/Presentation Title Agilent Technologies PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Zorbax主要的几种键合相技术 Agilent Technologies √Zorbax Eclipse XDB/Plus键合相 ·Zorbax StableBond 键合相 ·Zorbax Extend 键合相 ·Zorbax Bonus RP 键合相 Agilent Technologies Zorbax Eclipse键合相 Eclispe系列的色谱柱所适合的pH范围为2-9，是液相中最为常见的流动相范围。而且在中等pH时，由于其对碱性化合物的峰形分离优异(尤其是Eclipse Plus)， 一此一般做为方法开发的首选色谱柱。 ZORBAX Eclipse Plus 解决了“峰形”问题 由于硅胶上残留的硅羟基，碱性化合物通常会出现拖尾的现像 -低的灵敏度 -很差的分离度 -在指定时间内分离的峰数少 -很难定量 PLUS--针对碱性化合物而特别研制的色谱柱 Eclipse Plus可以做到!! ZORBAX Eclipse Plus C18 需要改进的峰形 ZORBAX Eclipse XDB-C18 3.5min 10 min 阿米替林~0.1ug，60%乙腈 8mM磷酸钾缓冲盐 pH 7.0，215nm， 1.0mL/min， 4.6x100mm 5p 色谱柱 Agilent Technologies PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com ZORBAX Eclipse Plus在甲醇流动相中分离阿米替林时峰形出色 阿米替林~0.1pg80%甲醇8mM磷酸钾缓冲盐 pH 7.0， 检测器： UV 215nm，流i速：1.0mL/min色谱柱：4.6x100mm 5um Tf= 1.26 Phenomenex LunaC18 (2) 在甲醇中峰形通常会比较好， Eclipse Plus 在这个条件下非常出色。 Agilent Technologies Eclipse Plus C18 对于酸碱混合物的分离峰形都是最好 1.水杨酸2.乙酰水杨酸3.右美沙芬 min Eclipse Plus色谱柱对各种类型的化合物一酸、碱和中性化合物一也可以得到优秀的结果 Agilent Technologies Eclipse Plus 分析样品的峰形最好 色谱柱：4.6x150 mm，5um流动相： 60：40水：甲醇流速：1ml/min柱温：40°CUV 254 nm 样品：皮质类固醇：1.曲安西龙2.泼尼松3.氢化可的松 4.可的松 N=10747 N=10968 Eclipse Plus C18 Tf= 1.03 TF=1.04 min 类固醇不是碱性化合物Eclipse Plus 同样有最好的峰形和柱效! Group/Presentation Title Agilent Technologies Agilent Restricted Zorbax Eclipse 色谱柱 (可定制规格) Eclipse Plus： 填料键合相：C18， C8， PAH， 苯基一己基。填料粒径：1.8 um， 3.5 um， 5 um.色谱柱规格：内径2.1 mm 3.0mm 4.6)mm长度从301 mm到250mm。 Eclipse XDB： 填料键合相：C18，C8，CN， Phenyl。 填料粒径：1.8um，3.5um， 5 um， 7um。 色谱柱规格： I内径从2.1 mm 21.2mm， 长度从30 mm到250mm。 以及毛细管柱(0.3 mm和0.5 mm)。 Agilent Technologies √Zorbax Eclipse XDB/Plus键合相√Zorbax StableBond 键合相 ·Zorbax Extend 键合相 ·Zorbax Bonus RP 键合相 Agilent Technologies ZORBAX StableBond色谱柱特点 专利的键合技术，为键合相提供了空间保护作用。具有行业领先的低pH流动相稳定性。 pH可以低至1，且允许在高温(80°℃)下操作。 普通硅胶交低 pH <2不稳定，发生水解 Zorbax StableBond空间位阻保护---抗水解能力 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com ZORBAX StableBond色谱柱 在低pH和高温(pH 0.8，90°C时)卓越的稳定性 StableBond SB-C18 (二异丁基-C18) ZORBAX Rx-C18(二甲基-C18) Competitor A-C18 Competitor B-C18 ▲Competitor C-C18 Competitor D-C18 Competitor E-C18 从上面的对比实验可以看出， StableBond系列色谱柱在低pH及高温下具有很好的稳定性。 Agilent Technologies SB系列中不容忽视的C18键合相：SB-Aq 通用性强虽100%水相及100%有机流动相 推荐用于强极性组分的分离 在含高水相的流动相中可获得高的保留 高纯度去活硅胶基质 超乎想象的稳定性一在低pH和高温(<80C)下，具有最长的柱寿命和最好的重现性 可用于PH1的酸性流动相 最高可用到80°℃的条件 保留的重现性较好---不发生"固定相坍塌"品种齐全 可用于： 提供从窄径柱，常规柱，到制备柱液质联用短柱及快速分离柱等 如果流动相中水相或缓冲盐相的比例超过85%，强烈推荐选用能耐高水相的色谱柱，请看以下两张幻灯片对比实验。 Group/Presentation Title Agilent Technologies Agilent Technologies SB-Aq在高水相比例的流动相条件下保留时间具有很好的重现性 Equilibrate with 50% ACN，then mobile phase No Phase CollapseNo loss in ResolutionAfter equilibrating with 100% bufferGood peak shape on all peaks Column： ZORBAX SB-Aq 4.6x 150 mm， 5 um Mobile Phase： 90% 50 mM KH2PO4， pH 3.5 10% ACN Flow Rate： 1.0 mL/minTemperature： RTDetection： UV 254 nm， 4 nmSample： 1. Uracil 2. Procainamide 3.N-acetylprocainamide 4. N-propionylprocainamide 3 5. Caffeine 2 4 5 耐100%水相色谱柱-SB-Aq 塔板数：12283 拖尾因子：1.01 供试品制备：精密量取本品1.0ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，精密量取该溶液1.0ml置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，制成每ml约0.25mg溶液，即得。 rir 色谱条件：色谱柱：ZZorbax SB-Aq C18， 4.6x250mm， 5um(880975-914)柱温： 35℃流动相：1%三氟乙酸水溶液蒸发管温度：115℃，空气流速：3.5mL/min流速：1.0mL/min 仪器配置： 二元泵 (G1312A) 手动进样器 (G1328B) 柱温箱(G1316A) 数模转换器 35900E 蒸发光散射检测器 Alltech 2000 仪器控制及数据处理： Agilent Chemstation Agilent Technologies SB-Aq可增强强极性样品的保留 水溶性维生素(不需离子对试剂) 未使用离子对试剂， SB-Aq 色谱柱对极性组分也能提供较好的保留方法重复性比使用离子对试剂更好 Zorbax StableBond 色谱柱 StableBond(80A)色谱柱 键合相： C18，C8， CN， C3， Phenyl， Ag 填料粒径：1.8 um， 3.5 um， 5 um， 7 um 规格：毛细管柱，快速分离柱，分析柱，半制备柱，高通量制备柱。 StableBond (300A) 色谱柱 键合相： C18，C8， CN， C3 填料粒径：3.5 um， 5 um， 7 um 规格：纳流色谱柱，毛细管柱，标准分析柱，半制备柱，高通量制备柱。 Agilent Technologies 大孔径填料适用于大分子分析 大孔径300A全多孔色谱柱 可用于分离蛋白质和多肽 分子量虽小但流体动力学体积较大的分子Poroshell (多孔壳)色谱柱 高流速下， 高柱效分析大分子的蛋白质和多肽 Agilent Technologies 300A孔径可改善大分子的峰形 色谱柱：4.6x150 mm， 5 mm 流动相：60% MeOH： 40% 0.1%三氟乙酸 分子量虽小但 hydrodynamic volume 窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍 Agilent Technologies PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 多肽和蛋白质分析 是快速分离蛋白质和多肽的理想色谱柱Poroshell填料颗粒由实心硅胶核和300A 孔径表面多孔层构成蛋白质(分子量可达1，000 kDa)和单克隆抗体的高柱效和高回收率四种不同的键合相，300SB-C18，300SB-C8，300SB-C3和300Extend-C18，优 化回收率和选择性 Poroshell填料 Agilent Technologies 快速，高分辨率分离蛋白质和多肽 完成一次单独的蛋白质消解产物色谱分析要用一小时或更长时间。采用 ZORBAX Poroshell色谱柱，同样的复杂分离在1/10的时间内就可完成。 Agilent Technologies √Zorbax Eclipse XDB/Plus键合相√Zorbax StableBond 键合相 √Zorbax Extend 键合相 ·Zorbax Bonus RP 键合相 Agilent Technologies ZORBAX Extend-C18色谱柱特点 专利双齿键合技术，为高pH流动相设计 最宽的pH流动相使用范围，可用于pH 2-11.5双封端保证了碱性化合物优异的峰形 硅胶基质，9比聚合物基质有更高柱效和更好峰形 Agilent Technologies Zorbax Extend C18高pH流动相分析碱性成分 色谱柱： ZORBAX Extend-C18， 4.6 x 150 mm， 5 mm 流动相：30%缓冲液：70% MeOH + ppH 7 缓冲液20 mM Na，HPO， pH 11缓冲液 20 mM TEA流速： 1.0 mL/min 温度： RT 检测器：UV 254 nm 高PH下.EXTEND C18可增加碱性化合物的保留及改善碱性成分峰形 Agilent Technologies PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com ZORBAX Extend-C18 HPLC色谱柱 —-Extend-C18 在高pH有长的柱寿命 Group/Presentation Title Zorbax Extend C18色谱柱 Zorbax Extend (80A)色谱柱 填料粒径：1.8 um， 3.5 um， 5 um 色谱柱规格：内径(mm)：1.0，2.1，3.0， 4.6， 21.2 长度(mm)： 30，50，100， 150，250 Zorbax Extend (300A)色谱柱 填料粒径：3.5 um， 5 um 色谱柱规格：内径(mm)：2.1，4.6 长度(mm)：50， 100， 150， 250 以及毛细管柱规格。 Agilent Technologies Zorbax主要键合相技术介绍 √Zorbax Eclipse XDB/Plus键合相√Zorbax StableBond 键合相 / Zorbax Extend 键合相 √Zorbax Bonus RP 键合相 Agilent Technologies C18键合相的另一种选择 R Zorbax Bonus-RP R CH Si一CH R1 极性酰胺键合相：与普通C18键合相相比，具有独特的选择性，耐受高水相比例空间位阻保护键合相和三封端：增强低 pH稳定性，碱性化合物峰形良好 CH Si一CH CH R Si R R Zorbax Bonus-RP C18 pH：2~9 温度：≤60C 碳覆盖率：9.5% 表面积：180m²/g 粒径：3.5，5um 孔径：80A 键合试剂： C18 封端：三 Agilent Technologies ZORBAX Bonus-RP HPLC色谱柱在中低pH值的稳定性测试 在低pH和中等pH时， ZORBAX Bonus-RP很稳定 色谱柱： 4.6x150mm 0，0018 竞争对手的烷基/酰胺柱 Bonus-RP 流动相： 60%25 mM 0，0016 部件号883668-901 磷酸盐缓冲液 0，0014 pH 7.0：40% ACN 0，0012 0.0010 流速：温度 ： 1.5mL/min 23C 0 5000 10，000 15.000 20，000 25.000 30.000 35，000 二甲基-C18/酰胺 一个月的工作时间。 Bonus-RP 部件号883668-901 立体保护侧基比类似的极性烷基键合相在低pH时稳定性更 高和色谱柱寿命更长，色柱： 4.6x150 mm 0.0055 流动相 0.0056 DimethyH-C18/amide 冲洗柱： 50%甲醇 Bonus-RP 0，0045'- 50% 0.1%三氟乙酸(TFA) 0，0040D- 流速 1.0 mL/min 0.0035 温度： 60°C 0.0030 流动相 0，0025 测试： 80%甲醇 20%水 0，0020 0 10，000 20.000 30.000 40.000 1.0mL/min 冲洗流动相的色谱柱体积数 23C Group/Presentation Title Agilent Technologies 色谱条件：色谱柱： Zorbax Bonus RP， 4.6x250mm， 5um(880688-901)柱温：35℃流动办：乙腈-0.1%磷酸溶液(4：96)检测波长：220nm流速：1.0mL/min 进样体积：10ul 仪器配置： 四元泵带真空脱气机(G1354A) 自动进样器 (G1367A) 柱温箱(G1316A) 紫外检测器(G1314A) 仪器控制及数据处理： Agilent Chemstation Agilent Technologies Bonus-RP与XDB-C8和SB-C8的不同的选择性 Zorbax Bonus-RP 色谱柱 填料粒径：1.8 um， 3.5 um， 5 um， 7 um色谱柱规格：内径(mm) 1.0， 2.1， 3.0， 4.6， 21.2柱长(mm) 30， 50， 75，100， 150， 250 分析柱，快速分离柱，节省溶剂柱，，窄径柱，彳微径柱，制备柱 Agilent Technologies ZORBAX主要反相键合相 系列 StableBond Eclipse Plus Eclipse XDB Extend Bonus-RP 键合相 C18， C8， C3，Phenyl，CN，AQ C18， C8， PAH，phenyl-hexy/ C18， C8，Phenyl， CN C18 C18 粒径 1.8，3.5，5，7um 1.8，3.5，5um 1.8，3.5，5，7um 1.8，3.5，5um 3.5，5，7um 内径 毛细管柱，1.0，2.1，3.0，4.6，9.4. 21.2mm 2.1，3.0，4.6mm 1.0，2.1，3.0，4.6， 9.4，21.2mm 毛细管柱，1.0，2.1，3.0，4.6， 21.2mm 1.0.2.1，3.0，4.6，21.2mm 柱长 20，30，50，75，100，150，250mm 30，50，75，100，150，250mm 20，30，50，75，100，150，250mm 30，50，100，150， 250mm 30，50，75，100150，250mm 耐受pH范围 1~8 2~9 2~9 2~11.5 2~9 特点 低pH流动相极其优异的稳定性；丰富的键合相选择 方法开发首选柱，对于碱性化合物峰形优异 方法开发首选柱，对于碱性化合物峰形优异 高pH流动相优异的稳定性 独特的选择性；高水相分离碱性化合物 主要内容 √Zorbax液相色谱柱介绍√Zorbax反相色谱柱选择建议 Agilent Technologies 色谱柱的选择 已知方法：键合相的选择色谱柱耐受范围未知方法：选择性 参见<色谱色谱柱规格的选择 柱的方法开检测要求 发>部份分离规模分析时间及溶剂节省 Agilent Technologies 干燥失置琅 盐酸氨溴索片c减 压干燥至Yansuan Anxiusuo Pian Ambroxol Hydrochloride Tablets【含量定】 加冰酸 20ml 本品含盐酸氨溴索(C13 H1g Br2 N2O· HCI)应为标示量 的95.0%~105.0%。4 .1610结果用空 白【性状】本品为白色或类白色片。(D.1mol/L)相当于 量【鉴别】(1)在量量测定项下记录的色谱图中，供式品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。(2)取溶出度项下的溶液，照紫外-可见分光光度法(附录 ⅣA)测定，在 244nm 与 308nm 的波长处有最大吸收。 Extend-C18 液相柱---pH选择策略 对于一个已知方法，选择色谱柱的首要思路应先从色谱条件尤其是流动相的pH值入手，考虑色谱柱所能耐受的流动相范围及柱温，这是保证方法稳定的基础和关键。 Agilent Technologies 安捷伦常见的液相色谱柱pH适用范围、温度，保存建议 键合相· pH适用范围 温度上限 长期保存建议 Zorhay 300SB C18 8 D00CnHe6 1000/7.時 Zorbax SIL+ 0.8~8 100%乙腈· Zorbax NH+ 2~7.5+ 60C(pH<6) 100%乙腈 Zorbax CNe 2~8 60C(pH<6) 100%乙腈+ Zorbax ODS+ 2~8+ 60C(pH<6) 100%乙腈+ Zorbax C8+ 2~8 60C(pH<6) 100%乙腈+ Zorbax TMS+ 2~7 60C(pH<6) 100%乙腈 Zorbax Carbohydrate+ 2~7.5= 60C(pH<6) 100%乙腈· Zorbax 300SCX+ 2~6.5+ 60C(pH<6) 100%乙腈· Zorbax SAX+ 2~7+ 40C(pH<6) 100%乙腈· Agilent TC C18+ 2~8+ 60°C(pH<6) 100%乙腈。 Agilent HC-C18+ 2~9+ 60C(pH<6) 100%乙腈 Agilent HC-C8+ 2~8+ 60C(pH<6) 100%乙腈。 Agilent Prep-C18+ 2~10 60°C(pH<6) 100%乙腈 在确定该方法选用C18固定相后， 请注意其所使用的流动相范围。 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以 0.01mol/L 磷酸氢二铵溶液(用磷酸调节pH值 在已知方法中如何选择HPLC色谱柱 对照品谱图 ".vlri mr1M 1 +0 .m 20 0 1. 1% nt 实际样品谱图 组分名称 保留时间 峰面积 塔板数 分离度 拖尾因子 [样品品谱图) (min) (mAU*s) (N) (Rs) (USP Tf 盐酸氨溴索 Ambroxol 9.00 490.6 16992 1.10 Hydrochloride Agilent Technologies 在已知方法中如何选择HPLC色谱柱 举例： 大 黄 现代 Dahuang ZORBAX柱* RADIX ET RHIZOMA RHEI Eclipse XDB StableBond 本品为蓼科植物掌叶大黄Rheum pliatum L.唐古特大黄 Rhewm tartguticum Maximt， ex Balf.或药用大黄 Rheumofficinale Baill.的干燥根及根茎。秋十茎叶枯或次春发芽前采挖+除去细根，刮去外皮，切瓣或段，细穿成申干燥或直接于燥， StableBond Aq ZORBAX Rx-C18 Bonus-RP Extend-C18 【含量测定】 照高效液相色谐法(附录WD)定， 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%磷酸溶液(85：15)为动相：按测长为254m，理论板数按大黄素峰计算应不低于3000， 低pH流动相， 使用SB C18能提供最佳的稳定性。 Agilent Technologies 在已知方法中如何选择HPLC色谱柱 mAU 30 25 20 15 10 5 0 ： 色谱条件： 5um (883975-902) 组分名称 k' 保留时 峰高 峰面积(mAU*s) 塔板数拖尾因子 间(min)(mAU) 大黄素 5.014 9.021 12.78 177.8 10115 1.02 大黄酚 7.064 12.096 9.23 158.8 11586 1.01 大黄酸 2.563 5.344 30.28 281.2 8174 1.09 芦荟大黄素 1.644 3.966 18.45 123.5 8387 1.06 大黄素甲醚 10.76 17.64 1.49 37.0 11579 1.00 Agilent Technologies 在已知方法中如何选择HPLC色谱柱 根据方法中所使用的固定相选定键合相 色谱条件中所使用的流动相的性质 如果流动相含有高于85%的水相 Bonus-RP 或 StableBond-Aq 酸性 当在尝试普通C18后得不到理想选择性时 Agilent Technologies 色谱柱的选择 键合相的选择 色谱柱耐受范围 选择性 色谱柱规格的选择 检测要求 分离规模 分析时间及溶剂节 省 未知方法：参见<色谱 柱的方法开发>部份 Agilent Technologies CH，CH(CH3)2 -OH +0-)Si—C8H37 OH CH2CH(CH3)2 StableBond 立体保护键合技术 不封端 6种键合相 StableBond： 推荐低pH下使用，保证长寿命Eclipse： 推荐 pH范围在2-9之间使用 CH -OSiMe， Zorbax Rx Silica -0- Si —C8H37 OSiMe?3CH， Eclipse Plus/XDB 致密键合相双封端 Plus三种键合相 XDB四种键合相 Zorbax液相色谱柱选择性比较 一酸碱混合物分离 SulfamethoxazoleAcid (pKa 5.6) HC N NHSO， NH OH5C2NHH，C2 O CaffeineBase (pKa 14.0) NH， CH Agilent Technologies Agilent Technologies 分离Procainamides/不同的键合相选择性比较 Increasing Hydrophobicity CONHCH2CH2N(C2H5)2 NHCOCH CONHCH2CH2N(C2H5)2 N-Acetylprocainamide NHCHCOCH3 N-Propionylprocainamide Agilent Technologies XDB分离Procainamides XDB-C18 Columns： 4.6 x 150 mm， 5 um Mobile Phase：90% 20mM Na2HPO4，pH 7.0：10% MeOH Flow Rate： 1.5 mL/min Temperature： 35°C Detection： UV 254 nm (2)N-Acetylprocainamide (3)N-Propionylprocainamide Columns： 4.6x150 mm，5 um Mobile Phase： 90% 20 mM KH，HPO4， pH 3.5： 10%AcN Flow Rate： 1.0 mL/min Temperature： 35°C Detection： UV 254 nm Agilent Technologies (1)Procainamide(2)N-Acetylprocainamide(3)N-Propionylprocainamide Columns： 4.6x 150 mm， 5 umMobile Phase： 90% 20 mM KH2HPO4， pH 3.5 ： 10% AcNFlow Rate： 1.0 mL/minTemperature： Ambient Group/Presentation Title 苯基-己基柱提供与C18/C8不同的选择性 60 Agilent Technologies Zorbax反相色谱柱选择的建议 General guidance on choosing a column based on sample type 较强极性 极性 中等极性 弱极性 SB-Aq Eclipse Plus/XDB-C8/C18 Eclipse Plus/ XDB-C18 Eclipse Plus XDB-C8 Bonus-RP Eclipse XDB-CN Eclipse Plus/ XDB-C8 Eclipse Plus/ XDB-C18 SB-C8 Eclipse XDB-Phenyl Eclipse XDB-CN Eclipse XDB-CN Eclipse XDB-Phenyl SB-C3 Eclipse XDB-Phenyl SB-C8 SB -all SB-C18 Other columns will work in some cases and could provide a better separation， depending on the actual analytes and excipients present in the sample. 结论：：色谱柱的键合相选择，主要从色谱柱的耐受性出发。而对于化合物选择性，流动相和色谱柱键合相不同，都会产生差异。 Agilent Technologies 色谱柱的选择 键合相的选择 色谱柱耐受范围 选择性 色谱柱规格的选择 分检测要求 分离规模 分析时间及溶剂节 省 未知方法：参见<色谱 柱的方法开发>部份 Agilent Technologies 键合相的选择 色谱柱耐受范围 选择性 色谱柱规格的选择 检测要求 通常质谱、ELSD检测器要求提供窄内径的色谱柱，如2.1 mm， 3.0mm. Agilent Technologies 色谱柱类型 内径(mm) 上样量 流速(ml/min) 灵敏度提高 应用范围 微型柱 毛细管柱 (填充或开管) 0.5， 0.3 1~10ug 1~15ul/min +++++ 较高灵敏度， LCMS，多肽，蛋白 微径柱 1.0 10~50 ug 10~100ul/min ++++ 高灵敏度， LCMS 纳流柱 (填充或开管) 0.1，0.075 100~200ng 200~500nl/min +++十十十 较高灵敏度，LCMS，多肽，蛋白 分析柱 窄径柱 2.1 50~120 ug 0.1~0.5 ++ 高灵敏度， LCMS，节省溶剂 溶剂节省柱 3.0 150~500ug 0.3~1.5 + 分析，节省溶剂 常规柱 4.0/4.6 0.1~1.5mg 0.5~3 常规分析 制备柱 半制备柱 9.4 1~10mg 5~10 mg级的制备 制备柱 >20 >20mg >20 数百mg~g的制备 安捷伦提供各种规格的色谱柱，请参见消耗品手册。 Group/Presentation Title Agilent Technologies 键合相的选择 色谱柱耐受范围 选择性 色谱柱规格的选择 检测要求分离规模 分析时间及溶剂节省 Agilent Technologies 节省溶剂或减少分离时间 减小柱内径------节省溶剂 ·流速改变，但分离时间不变 •灵敏度提高 减小柱长：------节省时间同时节省溶剂 ·较为简单，但要确保满足所需的分离度 同时减小多种参数------节省时间同时节省溶剂 •较短的色谱柱内填充较小粒径的柱填料-快速分离液相色谱柱(3.5um) -高分离度快速分离色谱柱(1.8um) Agilent Technologies 更小内径的色谱柱可以减少溶剂的使用 ColumnType I.D. (mm) Flow Rate(mL/min) Typical Flow RateRange Particle Sizes (um) Applications Analytical 4.6 1.0 1-2.5 mL/min 1.8， 3.5，5 Analytical SolventSaver 3.0 0.42 0.3-1.0 mL/min 1.8，3.5，5 Analytical， reducesolvent NarrowBore 2.1 0.21 0.1-0.5mL/min 1.8， 3.5， 5 LC/MS， reducesolvent Microbore 1.0 0.047 0.03-0.2mL/min 3.5，5 Sample limited，LC/MS Capillary 0.5 0.012 10-40 uL/min 3.5，5 Peptide Mapping，Sample limitedLC/MS Capillary 0.3 4.25 uL/min 2-20 uL/min 3.5，5 Peptide MappingLC/MS Nano 0.1 0.473 0.1-1ul/min 3.5 Proteomics， LC/MS uL/min Nano 0.075 0.266 0.1 -0.6 uL/min 3.5 Proteomics， LC/MS uL/min 不同内径的色谱柱分离抗菌药 Column： ZORBAX SB-C18 Mobile Phase*： 20% ACN： 80% Citrate/phosphate pH 2.6 *200/87/713 ACN/0.2M Na2HPO4/0.1M citric acidTemperature： ambient Sample： Antibacterials 1.Sulfamerazine 2. Furazolidone 3.Oxolinic acid4. Sulfadimethoxine 5. Sulfaqunioxoline6. Nalidixic acid SB-C18 Solvent SaverSB-C18 SB-C18 4.6 x 150 mm， 5 um Time (min) Solvent Used： 31 mL Flow Rate： 1.0 mL/minInjected： 3 uLDetector Cell Volume：8 uL 3.0 x150 mm， 5 um 1 0 Time (min) 40 Solvent Used： 15 mL% Solvent Saved = 52% Flow Rate： 0.5mL/minInjected： 2 uL Detector Cell Volume： 8 uL Solvent Used： 8 mL % Solvent Saved=74% Flow Rate：0.25 mL/minInjected： 1 uLDetector Cell Volume： 2 uL 减少色谱柱的柱长及填料粒径获得快速高分离度的结果并节省溶剂 USP Requirements： mAU L7 column 色谱柱的选择 键合相的选择 色谱柱耐受范围 选择性 色谱柱规格的选择 求 分离规模 分析时间及溶剂节 省 未知方法：<色谱柱的 方法开发> 部份(反相色谱) Agilent Technologies pH什么时候影响分离度?化合物类型比较 Group/Presentation Title Agilent Technologies ·不带电的化合物有较好的保留(比如酸性化合物在低pH值，碱性化合物在高pH) 硅胶上的硅羟基在中等pH值时离子化增加对碱性化合物的保留(可以存在离子交换的作用)在方法开发中选择流动相的pH值优化保留及选择性 >Eclipse Plus在中等pH范围对碱性化合物的峰形最佳 ·高pH时可以选择Extend C18，低pH值选择SB色谱柱 Agilent Technologies 流动相pH值变化对选择性的影响 1. procainamide 2. buspirone 3. pioglitazone 4. eletriptan 5. dipyridamole 6. diltiazem. 7.furosemide >可以看出pH值的变化影响了化合物的出峰顺序及分离度。 Conditions： Column： Eclipse Plus C18 4.6 x100mm， 5um Gradient： 10 - 90% in 10 minutes Detection： UV 254 nm Agilent Technologies 从低pH到高pH范围的方法开发指南5989-7282CHCN Agilent Technologies STEP1 选择 Eclipse Plus C18 Phenyl， 其反的反相键合相 >选择一根性能优越的 C18或 C8键合相作为方法开发的起始，这个键合相应对酸性、碱性及中性化合物都可以提供好的峰形和保留。 >优化流动相中有机相的组成以改变其选择性。 方法开发通常从pH3.0开始尝试 女如果样品中的某些化合物酸性较强，需要将流动相的pH调节在1-2时，请选择： SB-C18 色谱是经验科学，选择性的优化，只能通过不同的键合相来尝试实现。 方法开发步骤22-花在中等pH值下 >在低pH得不到满意的结果时，尝试中等pH，中等pH可能可以提供更好的选择性 >可能与你的样品更兼容 >在中等pH下方法优化步骤与低pH下相同 >Eclipse Plus 在中等pH值下性能优越 >如果需要改变选择性可以考虑其它键合相 Agilent Technologies STEP 9 ZORBAX Extend-C18 · pH 10.5(9-12) 5 mM ammonia， or TEA， or 10 - 50 mM 有机或硼酸缓冲液 ·T= 25℃ (ambient -40℃) ·调节MeOH for 0.5 碱性较强的样品 >通过将碱性化合物转变成非离子化的形式以增加其保留 >改进选择性 >此时，pH一般高于8，唯一的选择只有Extend-C18 采用Extend-C18在高pH下增加抗阻胺剂的保留 Column： ZORBAX Extend-C18， 4.6x150 mm， 5umMobile Phase： See Below Flow Rate： 1.0 mL/minTemperature： RT )etection： UV 254 nm Sample： 1. Maleate 2. Scopolamine 3. Pseudoephedrine 4. Doxylamine5. Chlorpheniramine 6. Triprolidine 7. Diphenhydramine pH 730% 20 mM Na，HPO，70% MeOH pH 11 t= 8.5 0 在高pH条件下增加了碱性化合物的保留。 Group/Presentation Title Agilent Technologies 大分子化合物 反相色谱分析-- 大孔径300A全多孔色谱柱可用于分离蛋白质和多肽 凝胶色谱分析-一 最容易预测和理解的HPLC模式主要用于生物大分子和合成高聚物质量控制 Agilent Technologies 流动相为水相的为GFC(凝胶过滤色谱) Agilent 可选柱为： >水相GFC启始工具盒 >Zorbax PSM的无“S”的色谱柱，如 PSM 300， >Zorbax GF-250/450 >PL aquagel-OH柱 流动相为有机相的为GPC(凝胶渗透色谱) Agilent 可选柱为： ·有机GPC启始工具盒 ·Plgel柱 ·Zorbax PSM的有“S”的色谱柱 Zorbax SAX和SCX离子交换柱 >基于稳定可靠的Zorbax硅胶基质，永久键合的季胺或磺酸基>对于水溶性小分子化合物和生物大分子提供高效分离 >与有机改性剂兼容 > Bio-SCXII系列专门为优化多肽和蛋白质的2DLC/MS分离而设计，具有极强的保留性能和良好的峰形 咳嗽——感冒药-ZORBAX 300SCX 核苷：单核苷酸的分离 1 色谱柱： ZORBAX SAX 4.6x250 mm. 5um 部件号880952-703 流动相： 0.1M NHH2PO4(pH 6.5) 流速： 2mL/min 温度： 20°C 检测： UV(254nm) 样品： 峰鉴定： 1.乳清酸 2.UMP 3. GMP 2 3 4.CMP 4 Time (min.) 0 2 4 6 810 Zorbax SCX用于三聚氰胺分析 (国标快速方法GB/T 22400-2008) 色谱柱： ZORBAX 300SCX 4.6×250mm， 5um 检测：240nm； 流速：1.5mL/min： 柱温： 30℃： 进样量：： 10u L： 流动相：50mM磷酸盐缓冲液 uii (pH3.0)：乙腈=60：40 手性柱 β-环糊精键合到多孔硅胶颗粒上，粒径5-10 um， ———L45 ChiraDex Chiral (79925CB-584)+卡套 5021+1845： 应用：巴比妥酸盐，苯并噻唑，钙拮抗剂， PTH-氨基酸 另外： Ultron手性柱 ES-OVM Column含有卵类粘蛋白， 分离药物对映异构体，比如己基巴比妥，布洛芬和普罗吩胺，氟苯氧丙胺、氯曲米通、cloperastin的对映体。 ES-Pepsin柱将胃蛋白酶键合在120A，5 um硅胶颗粒上。 应用：最适合于分离其它色谱柱难分离的碱性化合物。药物，，多肽，eperisone， 敏克静。 Agilent Technologies 氨基酸分析 ·Eclipse AAA色谱柱(氨基酸分析) 糖分析柱 ·Zorbax糖分析柱 寡核苷酸分析柱 ·Zorbax Oligo色谱柱(IEX/RP色谱柱) ·300Extend-C18 多环芳烃分析柱 多环芳烃柱(Eclipse PAH) Agilent Technologies 感谢您的关注与支持! 免费热线 800-820-3278 400-820-3278 Group/Presentation Title Agilent Technologies PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Group/Presentation TitleAgilent RestrictedPDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 色谱柱: 4.6 x150 mm, 5um 流动相: 60:40 水:甲醇 流速: 1 ml/min 柱温: 40 °C UV 254 nm 样品: 皮质类固醇: 1. 曲安西龙 2. 泼尼松 3. 氢化可的松 4. 可的松 尿17-羟皮质类固醇为尿中由肾上腺皮质所分泌的激素及其代谢产物。增高见于肾上腺皮质功能亢进(库欣综合征)、肾上腺皮质增生、肾上腺皮质瘤及双侧增生、甲状腺功能亢进、严重刺激和创伤、肥胖病、胰腺炎等。