厄贝沙坦中叠氮化物检测方案(离子色谱仪)

青岛盛瀚色谱技术有限公司 SHINE盛瀚离子色谱方案专家 离子色谱法测定厄贝沙坦中叠氮化物的含量 引言 厄贝沙坦是一种血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ， AngⅡ)受体抑制剂，血管紧张素Ⅱ受体分为AT1、AT2两种，厄贝沙坦通过选择性阻断AnglI 的 AT1受体，能抑制AngI转化为 AngI，能特异性地拮抗血管紧张素转换酶1受体(AT1)，对AT1的拮抗作用是 AT2 的8500倍，通过选择性地阻断 AngⅡ与AT1受体的结合，抑制血管收缩和醛固酮的释 放，产生降压作用。本品不抑制血管紧张素转换酶(ACE)、肾素、其它激素受体，也也抑制与血压调节和钠平衡有关的离子通道。厄贝沙坦还能减少心肌的电重构，从而减少高血压病人的致死率，是目前治疗高血压及心血管疾病最有效的药物。 血管紧张素拮抗剂(简称ARB)多应用于临床高血压及糖尿病肾病的治疗。目前国内治疗高血压的药物根据作用部位不同分为血管紧张素转换酶抑制剂(简称ACEI)，钙抗剂，[β-受体阻滞剂等几种，相比而言， ARB具有较好的降压疗效，而厄贝沙坦是一种新型的血管紧张素拮抗剂具有明确的降压作用，并有抑制左室肥厚保护肾脏等重要作用。厄贝沙坦为2-正丁基-3-[(2'-氰基联苯-4-基)甲基]-1，3-二氮杂螺[4，4]-壬-1-烯-4-酮(中间体)与叠氮化钠(NaN)经环加成制得，由合成工艺可知，产品中易引入叠氮根离子。 叠氮化合物可抑制细胞色素氧化酶及多种其酶活性，并导致磷酸化及细胞呼吸异常。叠氮酸及其钠盐主要急性毒作用引起血管张力极度降低，此系直接作用于血管平滑肌所致。该效应类似亚硝酸盐且较之更强，所不同之处烷基叠氮化物体内并引起高铁血红蛋白。叠氮化合物刺激呼吸，增强心博力；大剂量能升高血压全身痉挛继之抑制、休克。在有机叠氮物中，乙基叠氮化物和戊基叠氮化物为有效的降血管张力剂；但几种芳香族叠氮化物此作用不明显。叠氮化物有剧毒，半致死浓度为37.4mg/Kg。 根据《2020版中国药典》中的厄贝沙坦的检测要求，用阴离子交换色谱柱，检测器为电审核人签字： 导检测器，检测方式为抑制电导检测，用阀切换在线基体消除法对供试品溶液进样后在线处理后进行分析。 仪器配置及测试条件 盛瀚 CIC-D180 离子色谱仪 仪器条件与实验参数如下： 离子色谱条件 抑制器型号 SHY-A-6 抑制器电流 150mA 流速 1.0 mL/min 柱温箱温度 35℃ 电导池稳定温度 35℃ 色谱柱 SH-AC-23 表1淋洗液洗脱条件 时间(min) 淋洗液浓度 (mmol/L) 0 10 25 10 32 40 37 40 38 10 45 10 1. 溴化钾：标准物质 2. 叠氮化钠：：标准物质 3. 硝酸钾：标准物质 4. 超纯水：电阻率≥18.25 MQ·cm(25℃) 5. 乙腈： 色谱纯 6. 甲醇：色谱纯 流路连接详见图1，线路连接见图2。 图1.仪器管路连接 样品预处理过程； 待测物分离测定过程； A：废液 B：乙腈 C：超纯水 D：90%甲醇 图2.仪器电路连接 AC 220V AC 220~240V c串口 ( 1-淋洗液B； 2-淋洗液A； 3-电 导 ； 4 - 电脑： 7-INJECTB； 8-INJECTA ) 600寸紫盛 实验方案 (一)溶液配制 1.系统适用性溶液配制 分别精密称取溴化钾、叠氮化钠及硝酸钾各 10 mg， 置50mL容量瓶中，加90%甲醇溶液适量使溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密量取1mL， 置100 mL 容量瓶中，用90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀；再精密量取5mL，置50mL容量瓶中，用90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1mL中各含约 0.2 ug的溶液，作为系统适用性溶液。 2.对照品溶液配制 精密称取叠氮化钠对照品 6.2 mg， 置100 mL容量瓶中，加90%甲醇溶液适量使溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密量取5mL， 置100mL容量瓶中，用90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀；再精密量取5mL，置50mL容量瓶中，用90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1mL 中各含约 0.312ug(相当于每1mL中含叠氮根N-0.2 ug)的溶液，作为对照品溶液。 3.供试品溶液配制 精密称取本品 200mg， 置10 mL 容量瓶中，用90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1mL 中约含 20 ug 的溶液，作为供试品溶液。 (二)阀切换在线基体消除法 阀切换系统的工作流程图(图3~图5)，连接时尽量缩短仪器单元与单元之间的连接线，以减少死体积。 1.进样 供试品溶液装载到定量环(六通阀1处于Load 状态，六通阀2处于 Inject状态)，预处理柱(NG1 柱，35mm×4mm)通过外接的梯度泵用超纯水进行平衡；富集柱(TAC-UPL1， 23 mm×5mm)与分析柱相连。 图3进样过程 2.样品预处理过程 进样后(六通阀1处于 Inject 状态，六通阀2处于 Load状态)，梯度泵用超纯水冲洗 NG1 柱和 TAC-UPL1柱，供试品溶液随超纯水进去 NG1 柱和TAC-UPL1柱中，由于疏水性厄贝沙坦被吸附在 NG1柱中，待测物叠氮化物在NG1柱中不保留，叠氮化物经 NG1 柱洗脱后被富集在TAC-UPL1 柱中(该分析过程约4分钟)。 图4样品预处理过程 3.待测物分离测定过程 约4分钟后(切阀时间经方法摸索后才能确定，可以避免厄贝沙坦及溶剂甲醇的干扰，并保证N3没有损失)，六通阀切换至图5状态(六通阀1主语 Load状态，六通阀2处于 Inject 状态)， TAC-UPL1 柱与分离柱连接，被富集的N3经淋洗液梯度洗脱后，进行离子色谱分析；同时梯度泵流动相切换为乙腈，用乙腈洗脱 NG1 柱中截留的厄贝沙坦。 图5待测物分离测定过程 (三)离子色谱分析标准图谱 图6对照品溶液色谱图 二、方法验证 (一)离子色谱仪 CIC-D180 验证所用方法 取本品，精密称定，加90%甲醇溶液溶解并定量稀释制成每lml 中约含 20mg的溶液，作为供试品溶液：另取叠氮化钠对照品，精密称定，加90%甲醇溶液溶解并定量稀释制成每1ml 中约含叠氮化钠 0.312ug[相当于每 lml 中含叠氮根(N3)0.2ug]的溶液，作为对照品溶液；取溴化钾、叠氮化钠和硝酸钾各适量，加90%甲醇溶液溶解并稀释制成每 lml 中各约含 0.2ug的混合溶液，作为系统适用性溶液。照离子色谱法(四部通则0513)试验，用阴离子交换色谱柱，检测器为电导检测器，检测方式为抑制电导检测，柱温35℃。以氢氧化钾溶液为淋洗液，按下表程序进行分析柱浓度梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml。用阀切换在线基体消除法对供试品溶液进样后在线处理。照上述色谱条件，取系统适用性溶液200u1， 注入离子色谱仪，叠氮根与溴离子及硝酸根的分离度应大于1.5：精密量取供试品溶液与对照品溶液200p1，分别注入离子色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如显叠氮化物峰，按外标法以峰面积计算，不得过0.001%。 梯度洗脱执行下表： 表1梯度洗脱程序参数 时间 (min) 淋洗液浓度 (mol/L) 0~23 9×10-3 23.1~30 40×103 30.1~40 9×103 阀切换参数设置： 表2阀切换程序参数 阀 时间 进样阀1 0.1min INJECT 进样阀1 3min LOAD 清洗阀1 3min ON 清洗阀1 4min OFF 离子色谱仪 (CIC-D180)需要设置的方法参数： 离子色谱条件 抑制器型号 SHY-A-6 抑制器电流 150mA 流速 1.0 mL/min 柱温箱温度 35℃ 电导池稳定温度 35℃ 电导参数 量程2档范围：1000mV 色谱柱 SH-AC-23 数据采集频率 5 HZ (二)验证内容 1.系统适用性试验 (1)溶液配制 精密称取溴化钾 11.42mg、叠氮化钠 10.70mg 和硝酸钾 10.35mg， 置同一50ml量瓶中，加90%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液 1ml， 置100ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1ml， 置10ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀制成每lml 中各约含0.2ug的混合溶液，作为系统适用性溶液。 精密称取叠氮化钠对照品 31.40mg，置10ml量瓶中，加90%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1ml， 置100ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1ml， 置100ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀制成每lml中约含叠氮化钠 0.312ug[相当于每 lml中含叠氮根(N3)0.2ug]的溶液，作为对照品溶液。 (2)验证标准 叠氮根能被有效检测出且叠氮根与溴离子及硝酸根的分离度应大于1.5。 ( 地址：青岛市崂山区株株路151号 ) 表3系统适用性结果汇总表 名称 保留时间/min A 分离度 理论塔板数 Br 17.720 241.641 / 7875 N3 20.080 406.109 2.704 7123 NO 22.000 705.465 1.987 7971 叠氮化钠对照 20.083 546.459 / / 2.定量限及检测限 (1)溶液配制 精密称取叠叠化钠对照品31.40mg，置10ml量瓶中，加90%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液 1ml， 置100ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1ml， 置100ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀制成每 lml中约含叠氮化钠 0.312ug[相当于每 lml 中含叠根根(N3)0.2ug]的溶液，作为对照品溶液。 定量限溶液：精密量取叠氮化钠对照品溶液5ml， 置20ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。 检测限溶液：精密量取定量限溶液2ml，置10ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。 (2)验证标准 配制一定浓度的叠氮化钠溶液，当其信噪比为10：1时，确定叠氮根离子的定量限。同一样品连续进6针， RSD 应<6。 配制一定浓度的叠氮化钠溶液，当其信噪比为3：1时，确定叠氮根离子的检测限。 表4定量限及检测限结果汇总表 名称 C(ug/ml) A1 A2 A3 RSD% S/N 定量限 N3 0.051 111.794 114.445 114.082 1.4 约10 A4 A5 A6 111.54 112.738 110.172 检测限 N3 0.010 27.258 24.184 / / 约5 3.线性 (1)溶液配制 精密称取叠氮化钠对照品 31.40mg，置10ml量瓶中，加90%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为叠氮化钠对照品储备溶液。 叠氮化钠对照品溶液：精密量取叠氮化钠储备溶液1ml， 置100ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。 线性溶液1：即为上述定量限溶液； 线性溶液2：精密量取叠氮化钠对照品溶液5ml， 置10ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得； 线性溶液3：即为上述叠氮化钠对照品溶液； 线性溶液4：精密量取叠氮化钠储备溶液1.2ml，置100ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。 线性溶液4：精密量取叠氮化钠储备溶液 1.5ml，置100ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。 (2)验证标准 计算浓度相对于响应值的线性回归方程，r≥0.999。 表5线性结果汇总表 名称 C(ug/ml) A1 A2 A均 线性-1 N3 0.051 109.292 108.42 108.856 线性-2 0.101 233.343 238.444 235.894 线性-3 0.203 510.804 510.527 510.666 线性-4 0.243 623.713 624.425 624.069 线性-5 0.304 786.313 788.649 787.481 4.精密度 (1)溶液配制 精密称取叠氮化钠对照品 31.40mg，置10ml量瓶中，加90%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1ml， 置100ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为叠氮化钠对照品储备溶液。 叠氮化钠对照品溶液：精密量取叠取化钠储备溶液1ml， 置100ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。 (2)验证标准 连续进6针叠氮化钠对照品溶液， RSD 应≤2。 表6精密度结果汇总表 名称 C(ug/ml) A1 A2 A3 RSD% 精密度 N3 0.203 511.306 510.227 507.872 0.3 A4 A5 A6 508.885 112.738 508.435 5.稳定性 (1)溶液配制 精密称取溴化钾 11.42mg、叠氮化钠 10.70mg 和硝酸钾10.35mg， 置同一 50ml量瓶中，加90%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液 1ml， 置100ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1ml， 置10ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至 刻度，摇匀制成每 lml 中各约含 0.2ug 的混合溶液，作为系统适用性溶液。 精密称取叠氮化钠对照品适量，置10ml量瓶中，加90%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1ml， 置100ml量瓶中，加90%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀制成每lml 中约含叠氮化钠0.312ug[相当于每lml中含叠氮根(N3-)0.2ug]的溶液，《作为对照品溶液。 (2)验证标准 1月之内每隔1周进行1次精密度试验，连续进6针叠氮化钠对照品溶液， RSD 应≤2，1个月内4次精密度结果 RSD应≤11，且系统适用性符合要求。 表7稳定性结果汇总表 名称 保留时间/min A 分离度 理论塔板数 Br 17.720 241.641 / 7875 N3 20.080 406.109 2.704 7123 NO3 22.000 705.465 1.987 7971 第1次 A1 A2 A3 A4 A5 A6 RSD% 511.306 510.227 507.872 508.885 112.738 508.435 0.3 名称 保留时间/min A 分离度 理论塔板数 Br 17.830 184.568 / 7861 N3 20.180 378.044 2.252 5997 NO3 22.163 419.951 1.843 6311 第2次 A1 A2 A3 A4 A5 A6 RSD% 455.884 457.684 456.836 456.809 455.477 453.739 0.30 名称 保留时间/min A 分离度 理论塔板数 Br 17.780 213.532 / 8158 N3 20.123 345.854 2.729 7416 NO3 22.083 623.569 2.029 7761 第3次 A1 A2 A3 A4 A5 A6 RSD% 467.992 457.381 462.093 459.777 459.080 459.217 0.82 名称 保留时间/min A 分离度 理论塔板数 Br 17.787 208.684 / 8404 N3 20.130 409.963 2.659 6597 NO 3 22.080 511.083 1.918 7102 第4次 A1 A2 A3 A4 A5 A6 RSD% 485.088 488.329 486.781 487.904 490.009 492.485 0.53 四次结果RSD% 4.64 6.耐用性 (1)内容 分别改变柱温(30℃、40℃)、流速(0.8ml/min、1.2ml/ml)、初始淋洗液浓度(8.5mM、10mM)进行系统适用性试验及叠氮化钠对照品溶液检测。 (2)验证标准 叠氮根能有被有效检测，且叠氮根与溴离子及硝酸根的分离度应大于1.5。 表8耐用性结果汇总表 名称 保留时间/min A 分离度 理论塔板数 正常条件 Br 17.720 241.641 / 7875 N3 20.080 406.109 2.704 7123 NO 3 22.000 705.465 1.987 7971 叠氮化钠对照 20.083 546.459 / / 名称 保留时间/min A 分离度 理论塔板数 30℃ Br 18.073 351.252 / 5140 N3 20.503 421.273 2.319 5627 NO3 22.517 460.972 1.809 6257 叠氮化钠对照 20.5 528.554 / 名称 保留时间/min A 分离度 理论塔板数 40℃ Br 17.707 238.774 / 7753 N3 20.033 347.513 2.718 7720 NO3 21.993 596.903 2.065 7875 叠氮化钠对照 20.02 517.967 / / 名称 保留时间/min A 分离度 理论塔板数 0.8ml/min Br 22.317 282.967 / 7837 N3 25.270 422.171 2.766 7960 NO3 27.347 357.924 2.589 52845 叠氮化钠对照 25.267 621.344 / / 名称 保留时间/min A 分离度 理论塔板数 1.2ml/min Br 14.870 150.874 / 7530 N3 16.837 231.346 2.709 7642 NO 3 18.473 313.542 2.069 8206 叠氮化钠对照 16.837 367.624 / / 名称 保留时间/min A 分离度 理论塔板数 8.5mM Br 18.740 216.278 / 7887 N3 21.237 328.423 2.788 7967 NO3 23.340 365.668 2.158 8670 叠氮化钠对照 21.233 492.706 / / 名称 保留时间/min A 分离度 理论塔板数 10mM Br 16.393 177.102 / 8052 N3 18.513 296.803 2.719 7908 NO3 20.257 353.604 2.05 8627 叠氮化钠对照 18.52 444.203 / / 三、测试结论 经上述测试数据证明，仪器运行稳定，所有测试数据达到验证标准要求。 本文根据}《2020版中国药典》中的厄贝沙坦的检测要求，用阴离子交换色谱柱，检测器为电导检测器，检测方式为抑制电导检测，用阀切换在线基体消除法对供试品溶液进样后在线处理后进行分析，测定厄贝沙坦中的叠氮化物含量，有效分离检测出叠氮化物，并合理计算出叠氮化物的含量。该方法参考，灵敏度高，线性范围宽，有较好的精密度和准确度，可以用于厄贝沙坦中的叠氮化物含量的分析检测。 D180 离子色谱仪搭配 Clarity 工作站，能够在硬件和软件两方面满足客户对于产品的检测需求。Clarity 工作站是基于Windows32 位系统开发的软件，友好的图形化用户界面，熟悉的视窗操作风格使色谱更易于操作。Clarity 全面支持 GLP/FDA-21CFR Part11 电子署名认证、数据有效性安全性、系统认证工具(IQ/OQ)及系统适用性测试(SST)等要求。Clarity高效的批处理功能使仪器的控制、自动进样器序列采集、自动积分校正及输出报告均可一气呵成，将日常繁琐的分析简单化，强大的后处理功能，，谱图比较、重校正、 数据的输入输出、三维谱图处理等功能一应俱全。 地址：青岛市崂山区株洲路第页，共网址： www.sheng-han.com全国免费客服热线： 小科普 · 厄贝沙坦厄贝沙坦是一种血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)受体抑制剂，通过选择性地阻断AngⅡ与AT1受体的结合，抑制血管收缩和醛固酮的释放，产生降压作用。厄贝沙坦还能减少心肌的电重构，从而减少高血压病人的致死率，是目前治疗高血压及心血管疾病最有效的药物。厄贝沙坦合成工艺中，易引入叠氮根离子。叠氮化合物可抑制细胞色素氧化酶及多种其酶活性，并导致磷酸化及细胞呼吸异常。叠氮化合物刺激呼吸，增强心博力，大剂量能升高血压全身痉挛继之抑制、休克，且有剧毒，半致死浓度为37.4mg/Kg。根据《2020版中国药典》中的厄贝沙坦的检测要求，使用阴离子交换色谱柱、电导检测器及抑制电导检测方式，采用阀切换在线基体消除法对供试品溶液进样后在线处理后进行分析。1仪器及测试条件CIC-D180智能型离子色谱仪仪器条件与实验参数如下：离子色谱条件抑制器型号SHY-A-6抑制器电流150 mA流速1.0 mL/min柱温箱温度35℃电导池稳定温度35℃色谱柱SH-AC-23淋洗液洗脱条件时间（min）淋洗液浓度（mmol/L）010251032403740381045102试剂及标准溶液溴化钾：标准物质叠氮化钠：标准物质硝酸钾：标准物质超纯水：电阻率≥18.25 MΩ·cm（25℃）乙腈： 色谱纯甲醇：色谱纯▲ 标准谱图3方法验证1.系统适用性试验验证标准：叠氮根能被有效检测出且叠氮根与溴离子及硝酸根的分离度应大于1.5。▲ 系统适用性结果汇总表2. 定量限及检测限验证标准：配制一定浓度的叠氮化钠溶液，当其信噪比为10:1时，确定叠氮根离子的定量限。同一样品连续进6针，RSD应＜6。配制一定浓度的叠氮化钠溶液，当其信噪比为3:1时，确定叠氮根离子的检测限。▲定量限及检测限结果汇总表3.线性验证标准：计算浓度相对于响应值的线性回归方程，r≥0.999。4.精密度验证标准：连续进6针叠氮化钠对照品溶液，RSD应≤2。▲精密度结果汇总表……更多请下载详细方案经上述测试数据证明，仪器运行稳定，所有测试数据达到验证标准要求。本文根据《2020版中国药典》中的厄贝沙坦的检测要求，使用阴离子交换色谱柱、电导检测器、抑制电导检测方式，采用阀切换在线基体消除法对供试品溶液进样后在线处理后进行分析，测定厄贝沙坦中的叠氮化物含量，有效分离检测出叠氮化物，并合理计算出叠氮化物的含量。该方法灵敏度高、线性范围宽，有较好的精密度和准确度，可以用于厄贝沙坦中的叠氮化物含量的分析检测。盛瀚CIC-D180智能型离子色谱仪，实现了手机APP远程操控和信息资源共享，大大提高了工作效率。模块化的设计也为不同需求的分析工作者提供了更多可能，可做双系统，可搭配多种检测器等。