食品和植物中Glyphosate检测方案(液质联用仪)

Food and Environmental LAB SCIEX International SalesFor our office locations please call the divisionheadquarters or refer to our website atwww.absciex.com/offices500 Old Connecticut Path， Framingham， MA 01701USA Phone 508-383-7700www.sciex.com LC-MS/MS分析食品和植物中未衍生草甘膦及相似极性杀虫剂 Stephen Lock and Hermann Unterluggauer² 'AB SCIEX Warrington (UK) ‘Austrian Agency for Health and Food Safety (AGES GmbH)， Innsbruck (Austria) 草甘膦是一种广谱除草剂，广泛用于杀灭杂草，尤其是一年生阔叶类杂草和常见与作物竞争生长的杂草。草甘膦的极性很强，所以通常分析前需要与芴酰氯 (FMOC-CL)反应，经 FMOC衍生后被测试。衍生过程增加了分析的复杂程度，所以在一个方法中建立无需衍生的分析方法的需求逐渐增加，并且希望同时可以分析除草甘膦(Glyphosate)及其主要代谢产物AMPA外，草铵膦(Glufosinate)及其相似的强极性化合物(Ethephon)。此外，如果前处理采用简便的QuEChERS(快速、简单、低廉、高效、可靠以及安全)或者溶剂萃取方法提取，整个分析方案将会更加有吸引力。 这里我们介绍一种新 LC-MS/MS 分析方法，用于无需衍生的草甘膦及其相似极性的杀虫剂检测。实验中展示的原始数据建立在 AB SCIEX公司 LC-MS/MS 平台上，利用 HILIC 色谱柱分离，通过不同食物基质中添加标准溶液的方式模拟日常检测工作。实验中使用溶剂萃取提取样品，得到采集的原始数据，这些数据用于展示如何利用该方法检测食品中草甘膦等强极性化合物。 实验 样品制备 用于线性及灵敏度测试的校正曲线浓度范围 1-500ng/mL，稀释溶剂为 50/50的甲醇/水溶液。 基质选择洋葱，小麦，水稻和葡萄样品，以50%甲醇水溶液提取。样品的制备过程参考欧盟实验室的农药残留 QuPPe(强极性农药)方法，对洋葱，小麦，水稻和葡萄样品进行处理。提取液经50%甲醇水溶液稀释5倍后经 LC-MS/MS分析，以减少可能存在的基质效应。 液相色谱LC 液相系统采用岛津 LC-20AXR，，配两个岛津LC20AD 液相泵， SIL20AC 自动进样器，以及一个 CTO20A 柱温箱。化合物在Obelisc N 相 HPLC 流动相梯度见表1，这里流动相A 相为酸化85%乙腈/水含醋酸胺溶液(乙腈/水：85/15)，B相为酸化含醋酸胺的水溶液。 表1用于分离的流动相梯度 Step Time Flow(mL/min) A(%) B(%) 0 2 1.2 100 0 1 3 1.2 100 0 2 3.6 1.2 0 100 3 8 1.2 0 100 4 8 1.5 0 100 5 8.2 1.5 100 0 6 13.5 1.5 100 0 7 13.8 1.2 100 0 8 14 1.2 100 0 质谱 MS/MS 4种杀虫剂化合物分析方法在 AB SCIEXQTRAPQ 5500 的 LC-MS/MS 系统上建立，配Turbo VM 离子源电离化合物，负离子模式，喷雾电压 IS 为-4500V。其它离子源参数：气帘气35psi，，喷雾气 (Gas1) 60psi，干燥气(Gas2)70psi，碰撞气(CAD) 为 medium， 离子源温度650℃.MRM 离子对及化合物保留时间列于表2，每个MRM 离子对的驻留时间(dwell time) 设置50ms。 表2化合物 LC-MS/MS参数 Compound RT Q1 Q3 CE (min) (amu) (amu) (eV) AMPA 4.3 110 79 -24 110 63 -60 -26 Ethephon 7.4 143 79 -45 -26 143 107 -45 -12 Glufosinate 6.0 180 63 -60 -66 180 95 -60 Glyphosate 6.8 168 79 -110 168 63 -110 结果与讨论 图1展示一次进样采集浓度为 10ng/mL标准溶液的色谱图，图中包含的4种杀虫剂的色谱图。每个化合物监测两个离子对，并且利用 MRM 离子对的比例对化合物进行定性确证。 图1含量为10ng/mL标准溶液色谱图 图2和表3中展示了目标杀虫剂的校正曲线，化合物在 1-500ng/mL 范围内线性回归，线性权重按1/X 计算。经定量计算后，可以看到所有校正曲线上点的准确度在80-120%之间。 方法中不同化合物的灵敏度列于表3中。所有杀虫剂均能轻易被识别并定量，满足EU 和CODEX Alimentarius 化合物最大残留限量(MRL)要求(规定的水果、蔬菜中最大残留限量为0.1mg/kg) 2-3。检测方法的灵敏度足够高，所以允许对提取溶液进行稀释以期望尽可能减少基质干扰。 表3化合物在1-500ng/mL 测试范围内线性回归，线性权重按 1/X 计算时浓度为 1ng/mL 标准溶液的信噪比 (S/N*) Compound MRM Linear S/N transition fit(r值) 1 ng/mL AMPA 110/79 0.999 131 110/63 0.999 234 Ethephon 143/79 0.979 58 143/107 0.984 155 Glufosinate 180/63 1.000 88 180/95 0.999 47 Glyphosate 168/79 0.999 52 168/63 0.999 102 *S/N值由MultiQuant 软件自动计算 图2极性杀虫剂浓度 1-500ng/mL范围内校正曲线(分别展示2MRM 离子对回归曲线) 方法的验证使用标准添加到基质中来衡量。图3和图4展示4种不同极性杀虫剂，基质中添加标准的水平控制在0.1mg/kg时的色谱图(EU最大残留量)。实验中使用洋葱、小麦等四种基质，针对不同基质分别进行测试。 表4中展示了相同含量的4种杀虫剂在四种不同基质中的 S/N 数据。实验中5倍稀释提取液发现，化合物的保留时间出现轻微漂移，并且化合物信号强度出现抑制/增强现象。正因为如此，建议实验中通过添加内标的方式对化合物进行定量校正，同位素标记法能够确保定量的准确性。 图3100ug/kg添加到大米基质中乙腈稀释5倍后色谱图 图4100ug/kg添加到葡萄基质中乙腈稀释5倍后色谱图 表4含量为 0.1mg/kg 的基质加标样品稀释后基质抑制和增强的信噪比(S/N*) AMPA Ethephon Glufosinate Glyphosate 110/79 110/63 143/79 143/107 180/63 180/95 168/79 168/63 Rice 2900 5483 998 998 3058 653 911 3110 Onion 761 1379 281 2514 2310 373 249 1312 Grapes 1187 2344 133 1149 2892 440 534 1799 Wheat 1636 3117 174 1014 3062 557 588 2708 *S/N值由MultiQuant 软件自动计算 表5不加内标添加 100ug/kg 到不同基质中得到的回收率数据。数据展示受不同基质效应影响，导致回收率出现偏差，如果想解决这一问题需要添加内标或采集标准曲线的基质与样品一致的方式校正基质的影响 AMPA Ethephon Glufosinate Glyphosate Rice 151% 159% 148% 156% Onion 48% 243% 99% 92% Grapes 110% 167% 145% 95% Wheat 106% 213% 155% 155% 数据分析利用 MultiQuant软件2.1版，软件中带“多条件”筛选功能。筛选文件可根据客户需要定义不同的条件，具有“可定制”性。“多条件”筛选功能自动按条件筛选和对比 MRM 比例，用于突出显示超过用户设定浓度或条件的样品和鉴别化合物的真伪。图5中展示数据采集后运行筛选条件，得到的定量结果和色谱峰。 图 5MultiQuantM软件自动报告杀虫剂运行“多条件”筛选功能：设定筛选条件为MRM 比例和标记出超过最大残留限量的样品 总结 研究中清楚的展示了草甘膦及一些相似极性的杀虫剂分析方法，该方法可用于定量检测低水平的复杂基质样品，过程中无需衍生，仅需借助高灵敏度的 LC-MS/MS 系统分析样品。这样对质谱的灵敏度要求比较高，需要像 AB SCIEXQTRAP@5500 这样高灵敏度的质谱，利用新型HILIC 液相色谱柱分离。即使不是在最理想的酸性流动相条件下，即使流动相中水相比例非常高，即使流速超过 1mL/min， 由于使用 TurboVTM 离子源超强雾化能力，能够实现快速分析这些化合物。这意味着将不再需要 FMOC衍生或者超长的离子色谱分析方法分析草甘膦等强极性杀虫剂，采用本方法即可满足甚至超出分析要求。 4种化合物使用 MRM 离子对进行鉴别及定量分析，含量在 0.1mg/kg 的参考QuPPe 提取方法提取样品后稀释5倍。但是，即使稀释了5倍仍然不能完全确保消除基质效应，所以建议日常分析工作中添加内标或者采集标准曲线的基质与样品一致的方式对化合物进行定量分析。 ( 参考文献 ) ( 1http：//www.crlpesticides.eu/library/docs/srm/methQuPPe.pdf ) ( 2Regulation(EC) concerning the p l acing o f p l antprotection products on the market'No 1107/2009 ) ( 3Commission R egulation (EU) ‘regards maximum residue levels'No 441/2012 ) For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. ◎ 2013 AB SCIEX. The trademarks mentioned herein are the property of AB Sciex Pte. Ltd. or their respective owners. AB SCIEXTM is being used under license. Publication number：6940213-01 介绍一种新 LC-MS/MS 分析方法，用于无需衍生的草甘膦及其相似极性的杀虫剂检测。利用 HILIC 色谱柱分离，通过不同食物基质中添加标准溶液的方式模拟日常检测工作。实验中使用溶剂萃取提取样品，得到采集的原始数据，这些数据用于展示如何利用该方法检测食品中草甘膦等强极性化合物。研究中清楚的展示了草甘膦及一些相似极性的杀虫剂分析方法，该方法可用于定量检测低水平的复杂基质样品，过程中无需衍生，仅需借助高灵敏度的 LC-MS/MS 系统分析样品。这样对质谱的灵敏度要求比较高，需要像 AB SCIEX QTRAP 5500 这样高灵敏度的质谱，利用新型HILIC 液相色谱柱分离。即使不是在最理想的酸性流动相条件下，即使流动相中水相比例非常高，即使流速超过 1mL/min，由于使用 TurboVTM 离子源超强雾化能力，能够实现快速分析这些化合物。这意味着将不再需要 FMOC 衍生或者超长的离子色谱分析方法分析草甘膦等强极性杀虫剂，采用本方法即可满足甚至超出分析要求。