牛奶中磺胺甲恶唑残留检测方案(液质联用仪)

质谱参数优化 简介 抗生素曾被广泛用于兽药生产中，用于预防和治疗疾病及促生长剂 等。抗生素的滥用最终导致牛奶、肉类等动物源性食品中抗生素残留量严重超标，对人们健康带来风险。抗生素的残留会导致毒副反应，例如过敏反应、皮疹和恶心。另外，长期摄入抗生素残留的食品，会导致抗药性细菌的传播。因此，世界各国都实施了动物抗生素使用法规。例如，欧盟和加拿大制定了食品中药物最高残留量 (MRL))，，美国将其称为耐受水平。法规规定牛奶中抗生素残留种类包括磺胺类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类、大环内酯和四环素。本文中牛奶里各类抗生素的限量如表1所示。 本文建立了牛奶中抗生素多残留的LC/MS/MS测定方法。抗生素种类包括环丙沙星、环丙沙星、氧氟沙星、青霉素G、氯唑西林、替米考星、泰乐菌素、红霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧嘧啶、四环素和金霉素。以及两种同位素内标为环丙沙星-d8和氟尼辛-d3。采用改良的 QuEChERS 方法对牛奶中抗生素进行提取。本方法具有良好的线性，高灵敏度、回收率稳定、重现性高和特异性强的特点，满足世界各国监管机构规定的牛奶中抗生素类残留限量的要求。 表1-牛奶中的不同类抗生素清单及耐受限值。 化合物 抗生素种类 耐受水平 磺胺二甲嘧啶 磺胺类 10ng/ml 磺胺甲恶唑 磺胺类 10 ng/mlP 磺胺地索辛f 磺胺类 10 ng/ml 替米考星 大环内酯类 100 ng/ml 泰乐菌素 大环内酯类 50 ng/ml 红霉素 大环内酯类 50 ng/ml 青霉素G β-内酰胺 5 ng/ml 氯唑西林 β-内酰胺 10 ng/ml 氧氟沙星 氟喹诺酮 5ng/ml 环丙沙星 氟喹诺酮 5ng/mld 沙拉沙星 氟喹诺酮 5ng/mld 四环素 四环素 300 ng/mle 金霉素 四环素 300 ng/ml a US FDA/CFSAN 中规定的牛奶中耐受或安全残留限值1 b所列为“安全残留量”而不是耐受量 c牛奶中没有规定耐受量；本方法将其规定为100ng/mL(肌肉内耐受量)d未规定耐受或安全水平，本方法设定为 5ng/mL e耐受量包括各个抗生素的残留量以及总残留量，本方法设定各为 100ng/mL。f禁止对奶牛使用除标示外的磺胺类药物(磺胺地索辛除外) 1 实验方法 仪器设备 Perkinelmer Altus TM UPLC@ 液相系统，含 Altus A-30溶剂管理模块、样品管理器和柱温箱。质谱仪：Perkinelmer QSight TM 210 三重四极杆质谱仪。Simplicity3QTM软件平台控制所有仪器、采集和处理数据。 方法参数 液相色谱方法以及质谱离子源参数见表2。 溶剂、标准物及样品前处理 所用的溶剂、试剂和稀释液纯度均为 LC/MS 级。抗生素标准物购自 Sigma-Aldrich公司，并于4℃冰箱中保存。除了β-内酰胺类使用水作为溶剂外，其余抗生素均使用甲醇配制溶液。β-内酰安类标准溶液需保存于塑料瓶中，其余抗生素类标准溶液可保存在塑料或玻璃瓶中。 从C18净化剂购于 Supelco 公司。所有母液和工作标准溶液均冷藏保存，并使用2mL的棕色进样小瓶，以防止化合物降解。同位素内标的使用：环丙沙星-d8用于氟喹诺酮，磺胺类和四环素类，氟尼辛-d3用于大环内酯和β-内酰胺类。 表2-LC方法和 MS源参数 分析时间： 时间(分钟) %A %B 曲线 1 0 95.0 5.0 2 0.50 95.0 5.0 6 3 7.50 40.0 60.0 6 4 10.00 0.0 100.0 6 5 15.00 0.0 100.0 6 6 15.30 95 5.0 6 MS条件 电离模式： 电喷雾，正离子模式 干燥气体(氮气) 设置： 75 HSID TM 温度： 320℃ 电喷射电压： 5500V 离子源温度： 425℃ 雾化气体(氮气) 设置： 175 采用当地市场购得有机牛奶作为空白样品，并对不同 脂肪含量的5种牛奶样品进行抗生素残留检测。采用 简单改良过 QuEChERS 前处理方法2，3。具体步骤如 ( 下： 1)往5mL空白有机牛奶(已添加标准，浓度 为15ng/mL)中加入20mL有机溶剂(甲醇或乙腈) 1； (2)涡旋混匀1min，置于7800rpm 下离心 10min；(3)移取上清液，加入1.2mg的C18净化剂 ， 用于除去脂肪；(4)涡旋5min， 7800rpm下离心5分钟(5) 提取12.5mL上清液，于40℃用氮气吹至1.5-2mL； (6)用15%甲醇水溶液定容至2.5mL ， 涡旋混匀； (7)过 0.22pm PVDF微孔滤膜。本实验采用基质匹 ) 配标准曲线进行定量分析，待上述步骤7完成后在进行基质配标及添加内标，基质标准曲线范围在 0.1ng/mL-1000ng/mL，每个浓度点重复进样5次，进行精密度实验。 本实验研究的目标化合物均采用正离子模式的电喷雾模式检测。采用蠕动泵和液相色谱仪相结合，以三通连接的方式来优化质谱参数：如气体流量、离子源温度以及离子源的位置。蠕动泵以 10pL/min 的流速将0.5 ug/mL 磺胺甲嘧啶注入质谱，液相色谱仪以 0.5mL/min 的流速，溶液为乙腈水溶液 (VN，10/90，含0.1%甲酸， 5mM甲酸铵)注入质谱中。每个化合物均采用浓度为0.5 u g/mL 来优化碰撞能量。Q1和Q3的分辨率为0.7amu。各个化合的质谱参数详见表3，每个化合物均采集3对MRM离子对，以降低假阳性或假阴性结果。 结果与讨论 按照上述确定的实验方法进行测试，各各个抗生素的校准曲线相关系数及 LOQ 见表4。各个抗生素的 LOQ比法规中耐受水平还要低至5-100倍。实验结果表明，本方法完全满足牛奶中抗生素的检测要求。图1为牛奶基质加标样品(浓度为5ng/mL)中磺胺甲嘧啶的提取离子色谱图，从图1可以看出，具有较高的信噪比。采用空白牛奶基质作为稀释液，配制一系列浓度的标准曲线工作液(9个浓度点)，基质配标曲线范围为 0.1-1000ng/mL。图2为磺胺二甲嘧啶校准曲线示例，线性范围大于4个数量级。所有抗生素化合物的校准曲线线性相关系数R均大于0.9958，具有良好的线性关系。表5为目标化合物在不同浓度下连续进样的重现性数据。 表6展示了牛奶样品加标回收的实验结果。大环内酯类、 磺胺类和β-内内胺类抗生素回收率在70-120%之间，重现性 RSD 值小于20%：((n=5)。氟喹诺酮的绝对回收率为60-70%，但四环素的绝对回收率相对比较低，回收率为30%。同位素内标的回收率：环丙沙星-d8和氟尼辛-d3分别约70%和90%。氟喹诺酮和气代氟喹诺酮化合物在提取过程中会出现类似损失，故使用同位素内标来校正氟喹诺酮来化合物的回收率。采用环丙沙星-d8作为氟喹诺酮和四环素类的内标物，对提取过程的回收率进行校正。使用内标校正后氟喹诺酮的回收率范围为80-110%，而四环素约为30%。在今后的实验中可采用气代四环素作为四环素内标会得到更好的实验结果。表6还展示了不同溶剂的沉淀蛋白效果对回收率和基质效应的影响。除了红霉素外，其余目标化合物在乙腈和甲醇中的回收率相近，而红霉素采用乙腈和甲醇提取的回收率分别约为27%和98%。本文采用溶剂配制标准溶液与牛奶基质配制标准溶液的响应值之间进行比较，以获得牛奶基质效应情况。结果表明：无论甲醇还是乙腈提取样品，磺胺类、大环内酯类和β-内酰胺类化合物未见明显的基质效应。氟喹诺酮和四环素均有基质增益的效应，相对而言，两者在甲醇提取的基质增益更为显著。 利用上述确定的实验条件，分析了5个不同脂肪含量(1%到5%)的牛奶样品。实验结果表明，5个牛奶样品均未检出抗生素。两种内标化合物在不同脂脂含量的样品中，其回收率RSD 值均小于15%，这表明：化合物回收率与牛奶中的脂肪含量关系不大。本实验对每个化合物均监测了3对MRM离子对，其中2对MRM离子对 分析物 保留时间 /min 驻留时间 /ms 母离子 定量离子 CE/eV 定量离子1 CE/eV 定量离子2 CE/eV 磺胺二甲密啶 3.37 10 279.1 186 20 156 25 107.9 40 磺胺甲恶唑 4.38 10 254.1 107.9 40 91.7 55 156 30 磺胺地索辛 5.15 10 311.1 156 25 91.7 40 107.9 50 替米考星 4.93 30 435.3 695.4 20 174 30 87.9 55 泰乐菌素 5.70 30 916.5 174 46 100.9 64 144.9 48 红霉素 5.41 20 734.4 158 40 576.2 22 115.9 66 青霉素G 5.38 30 334.9 160 22 176 22 113.9 48 氯唑西林 6.6 30 436.2 277.1 18 113.9 62 178 50 氧氟沙星 3.30 10 361.9 317.9 25 343.9 25 260.9 35 环丙沙星 3.38 10 331.9 313.9 24 230.9 51 187.9 75 沙拉沙星 3.93 10 385.9 367.9 28 341.9 24 298.9 36 四环素 3.52 30 445.1 410.1 16 154 24 97.9 36 金霉素 4.33 30 479 444 26 462 22 154 36 环丙沙星-d8 3.36 10 340.1 235 48 - - - 氟尼辛-d3 7.20 10 300 282 30 - 用于化合物的定性确证。相对仅有一对离子丰度比，拥有两对MRM 的离子对丰度比的实验，具有更高的选择性和特异性。定性离子的峰面积与定量离子峰面积比值，作为离子丰度比。表7展示了目标化合物在牛奶基质中的平均离子丰度比。不同浓度水平下的相对离子比在平均离子丰度比±11%之间，低于食品中化学残留物分析SANCO 文件规定±30%的允许误差范围。 往牛奶空白样品提取液中添加标准品，磺胺类、氟喹诺酮类和β-内酰胺类的加标浓度为 10ng/mL，大环内酯类和四环素类化合物的加标浓度为 50ng/mL， 对系统进行长达6天的稳定性实验。图3展示了牛奶基质中10ng/mL 磺胺二甲嘧啶与内标物响应值进行归一化的数据。在连续6天进样，磺胺二甲嘧啶响应值未见明显下降。实验表明，该三重四极杆质谱仪系统具有优异稳定性。在6天的长期稳定性测试显示13种抗生素中有10种抗生素的信号强度无减弱。另外3种抗生素随着时间推移而降解，导致信号强度降低30%。 表4-牛奶基质中各类抗生素线性范围、相关系数以及 LOQ 化合物 LOQ 校准曲线浓度范围 相关系数R 磺胺二甲嘧啶 0.1 ng/ml 0.1-1000 ng/ml 0.9986 新诺明 0.1 ng/ml 0.1-1000 ng/ml 0.9996 磺胺地索辛 0.1 ng/ml 0.1-1000 ng/ml 0.9991 替米考星 0.1 ng/ml 0.1-1000 ng/ml 0.9990 泰乐菌素 ng/ml 1-1000 ng/ml 0.9980 红霉素 0.3 ng/ml 0.3-1000 ng/ml 0.9958 青霉素G 1 ng/ml 1-1000 ng/ml 0.9981 氯唑西林 1 ng/ml 1-1000 ng/ml 0.9985 氧氟沙星 0.1 ng/ml 0.1-1000 ng/ml 0.9982 环丙沙星 0.1 ng/ml 0.1-1000 ng/ml 0.9978 沙拉沙星 0.1 ng/ml 0.1-1000 ng/ml 0.9968 四环素 0.3 ng/ml 0.3-1000 ng/ml 0.9956 金霉素 0.3 ng/ml 0.3-1000 ng/ml 0.9984 图1-牛奶基质中磺胺二甲嘧啶的提取离子色谱图(浓度为5ng/mL)，A为定量离子对，B和C为定性离子对 图2-牛奶基质中磺胺二甲嘧啶校准曲线示例，浓度范围为 0.1-1000ng/mL，n=5 表5-牛奶基质中不同浓度水平下抗生素类化合物的重现性数据 化合物 2.5ng/mLRSD(n=5) 5ng/mLRSD (n=5) 10ng/mLRSD (n=5)|2 25ng/mLRSD (n=5) 50ng/mLRSD (n=5) 100ng/mLRSD (n=5) 磺胺二甲嘧啶 2.4% 2.4% 1.1% 1.4% 0.8% 0.7% 新诺明 3.5% 4.7% 2.8% 1.7% 2.9% 1.4% 磺胺地索辛 3.0% 0.8% 2.0% 1.6% 1.2% 1.7% 替米考星 0.7% 1.5% 1.8% 0.7% 0.8% 1.1% 泰乐菌素 7.8% 4.3% 3.9% 2.1% 2.2% 1.4% 红霉素 4.7% 3.8% 4.0% 1.7% 2.3% 0.8% 青霉素G 3.0% 4.4% 4.2% 1.4% 2.6% 1.5% 氯唑西林 4.5% 4.4% 3.7% 2.5% 1.8% 1.4% 氧氟沙星 2.9% 1.9% 2.6% 1.5% 1.7% 1.8% 环丙沙星 2.2% 2.3% 0.9% 3.1% 1.0% 1.1% 沙拉沙星 2.4% 2.8% 2.0% 1.5% 2.0% 0.7% 四环素 6.1% 5.9% 6.1% 4.7% 2.8% 1.3% 金霉素 5.6% 5.0% 5.7% 3.6% 4.1% 2.1% 表6-牛奶中抗生素类化合物在不同提取溶剂下的回收率实验数据 添加回收浓度 平均回收率 回收率RSD 基质效应 平均回收率 回收率RSD 基质效应 化合物 水平 (ng/mL) (甲醇) (甲醇) (甲醇) (乙腈) (乙腈) (乙腈) 磺胺二甲嘧啶 10 102% 8% 110% 101% 9% 102% 新诺明 10 103% 10% 93% 105% 13% 97% 磺胺地索辛 10 96% 7% 111% 104% 7% 106% 替米考星 50 89% 10% 127% 82% 15% 103% 泰乐菌素 50 97% 14% 83% 92% 17% 97% 红霉素 50 98% 11% 80% 27% 17% 91% 青霉素G 10 103% 10% 94% 84% 10% 96% 氯唑西林 10 94% 13% 97% 96% 13% 102% 氧氟沙星 10 101% 17% 163% 97% 1.7% 181% 环丙沙星 10 102% 16% 174% 87% 1.0% 163% 沙拉沙星 10 104% 11% 162% 96% 9% 142% 四环素 50 32% 5% 152% 24% 5% 120% 金霉素 50 25% 8% 177% 21% 10% 130% 表7-牛奶中不同浓度水平下抗生素类化合物物离子丰度比列表 化合物 离子比1 相对离子比1之差 离子比2 相对离子比2之差 磺胺二甲嘧啶 57% ±5% 43% ±6% 新诺明 99% ±5% 90% ±6% 磺胺地索辛 38% ±6% 29% ±5% 替米考星 76% ±5% 64% ±5% 泰乐菌素 44% ±6% 26% ±11% 红霉素 46% ±5% 24% ±6% 青霉素G 78% ±5% 50% ±10% 氯唑西林 43% ±5% 38% ±6% 氧氟沙星 69% ±9% 62% ±7% 环丙沙星 43% ±5% 2.5% ±12% 沙拉沙星 13% ±7% 8.1% ±7% 四环素 23% ±6% 21% ±10% 金霉素 68% ±6% 37% ±6% 图3-牛奶中磺胺二甲嘧啶的长期稳定数据示例(浓度为 10ng/mL，连续进样6天) 本文采用改良型 QuEChERS 样品前处理方法建立了牛奶中抗生素类多残留分析方法，该方法具有快速、稳定、可靠，高灵敏度和选择性等特点。经简单的样品前处理，大部分抗生素化合物获得了良好的回收率。本方法满足牛奶中痕量的抗生素残留进行定性定量分析要求，具有良好的精密度和稳定的保留时间。长期稳定性测试结果表明：该LC/MS/MS 系统适用于长期复杂基质的样品分析，也无需停机维护保养。 ( 1. US FDA/CFSAN Tolerance and /or Safe Levels of Animal Drug R esidues in Milk； memo dated Sep 27，2005. ) ( 2. S. B. C l ark， J. M. Storey， S. B. Turnipseed， FDA LaboratoryInformation Bulletin， Lib # 4443， http：//www.fda.gov/downloads/ScienceResearch/FieldScience/UCM239311.pdf. ) ( 3. L. Geis-Asteggiante， S. J. Lehotay， A. R.L i g h tfield， T. Dutko，C. Ng， L. Bluhm， J. Chrom.A， 2012，1 2 58，43. ) ( 4.T. Yamaguchi， M . Okihashi， K. Harada， K. Uchida， Y. Konishi，K. Kajimura， K . Hirata， Y. Yamamato， J. Agri. Food Chem.， 2015，63，5133. ) ( 5. E uropean Commission Guidance Document on Analytic a lQuality Control and Validation Procedures for ResiduesAnalysis in food and feed， SANCO12571(2013)，http：//ec.europa.eu/food/plant/pesticides/guidance_documents/docs/qualcontrol_ e n. p df ) 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 地址：上海张江高科技技区张衡路1670号邮编：201203电话：021-60645888传真：021-60645999www.perkinelmer.com.cn 要获取全球办事处的完整列表，请访问http：// www.perkinelmer.com.cn/AboutUs/ContactUs/ContactUs 本文建立了牛奶中抗生素多残留的LC/MS/MS测定方法。抗生素种类包括环丙沙星、环丙沙星、氧氟沙星、青霉素G、氯唑西林、替米考星、泰乐菌素、红霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧嘧啶、四环素和金霉素。以及两种同位素内标为环丙沙星-d8 和氟尼辛-d3。采用改良的QuEChERS 方法对牛奶中抗生素进行提取。本方法具有良好的线性，高灵敏度、回收率稳定、重现性高和特异性强的特点，满足世界各国监管机构规定的牛奶中抗生素类残留限量的要求。本文采用改良型QuEChERS 样品前处理方法建立了牛奶中抗生素类多残留分析方法，该方法具有快速、稳定、可靠，高灵敏度和选择性等特点。经简单的样品前处理，大部分抗生素化合物获得了良好的回收率。本方法满足牛奶中痕量的抗生素残留进行定性定量分析要求，具有良好的精密度和稳定的保留时间。长期稳定性测试结果表明：该LC/MS/MS 系统适用于长期复杂基质的样品分析，也无需停机维护保养。