水中吉他霉素药物检测方案(固相萃取仪)

Raykol Applications Collection-RKFT-W003 全自动固相萃取-高效液相色谱法串联质谱测定水中4种四环素和9种大环内脂类抗生素药物 近年来，在水环境中发现个人护理用品及药物的残留引起了人们的广泛关注。抗生素类药作为上述药物的一种，随着畜牧业养殖扩大而大肆用药，常以动物代谢产物随着动物的排泄物，屠宰血水或者人们对于废弃药物的不当处理等方式进入地球的水循环体系。另一方面渔业也有大面积使用抗生素的养殖方式，对水体产生非常大的破坏。 四环素类药物(图-1)作为广谱抑菌剂，高浓度时具有杀菌作用。大环内酯类(Macrolides)(图-2)是由链霉菌产生的一类弱碱性抗生素、因分子 中含有一个内酯结构的十四员或十六员大环而得名。然而过多地使用大环内脂类药物会对人体消化道产生极强的副作用，使人恶心，干呕，腹胀腹泻等，严重可致人不可逆的耳聋。 对于上述水环境中，如养殖废水，生活污水及渔业用水等，抗生素含量超标达到纳克每升甚至亚微克每升的污染现状，亟需一种检测手段对水中的抗生素进行检测。固相萃取作为一种富集净化的技术，能够很好将检出限降低至纳克每升，进而让水体中的污染物无所遁形。 图-1.四种四环素抗生素结构图 图-2.9种大环内脂抗生素结构 关键字：全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；磺胺抗生素 2.仪器和耗材 Raykol Fotector Plus 全自动固相萃取仪 高效液相色谱 (HPLC) Agilent 1260 HLB 固相萃取柱(CNW， 60 mg/3 mL) 质谱检测器(MS) Agilent 6410 氮气吹干装置： Raykol AutoEVA-60全自动平行浓缩仪 甲醇(优级纯)，水 3.样品富集与净化 3.1 固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科Fotector Plus/睿科Auto SPE 固相萃取柱 HLB (Waters， Oasis， 60 mg/3 mL) 活化 甲醇 淋洗 水溶液 洗脱 甲醇溶液 3.2样品富集与净化 依次用甲醇(10mL)和水(10mL)以 5.0mL/min 的速率活化/平衡和洗洗固相萃取柱，备用。取纯净水样200 mL， 加入EDTA-McIlvaine 缓冲溶 剂 (pH=4.0， 50mL， 0.1 mol/L)调节水环境的 pH值(采用0.1 mol/L 的氢氧化钠溶液调节，检测替米考星的水环境 pH 值需调节至4.30，检测其余大环内脂和四环素水环境 pH 为4.90)， 以 5-7 mL/min的速率经固相萃取小柱富集后；水溶液10 mL 以10mL/min 速率淋洗固相萃取柱中残留的 NazEDTA；吹干后用 10 mL的甲醇以1.0 mL/min 的速率洗脱。具体步骤见下图，收集的样品在 30℃， 5 psi 条件下浓缩至近干，流动相乙相-水溶液(3：7，v： v)定容至1.0mL， 供LC/MS-MS 分析。 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 体积(mL) 时间(min] 1 活化 CH30H 废液1 10 10 1.6 2 活化 H20 废液1 10 10 1.6 3 大体积上样 废液1 5 250 62.8 4 淋洗 H20 废液1 5 10 2.6 5 气推 废液1 40 20 1.8 6 吹干 5 清洗注射泵 CH30H 10 5 0.9 8 洗脱 CH30H 收集 1 10 10.5 9 气推 20 5 0.8 10 结束 图-3. Fotector Plus 对水中大环内脂的富集净化方法 4.液质检测条件 4.1色谱柱条件 柱子 流速 流动相 柱温 进样体积 检测器 离子模式 吹扫气 氮气温度 簇电压 雾化压力 梯度洗脱 Waters XBridge BEH HILIC 2.5 pmx21 mmx50 mm 0.200 mL/min A： 10mM ammonium acetic (0.1%formic acid)， B： Methanol 35°C 10uL Agilent 6410 ESI 11 L/min 350°C 4000 35psi 大环内脂：0.0-1.5 min， 93%的流动相A； 1.5-3.0 min， 60%的流动相A； 3.0-3.5 min， 10%流动相A， 保 持2 min； 5.50-6.0 min， 93%的流动相A； 6.00-10.0 min， 93%的流动相A。 四环素：0.0-0.50 min， 80%流动相A； 0.50-2.0 min， 30%流动相A， 保持2 min； 4.00-4.10 min， 90%流 动相A，保持3 min。 4.2 MRM 参数 表-1.4种四环素和9种大环内脂的串联质谱检测参数 4.3色谱图 下图为4种四环素类样品和9种大环内脂类化合物的 MRM 谱图： +ESI MRM Frag=120.0V CF=0.000 DF=0.000 CID@18.0 (479.2000->444.1000) BY03.d 金霉素 +ESI MRM Frag=125. 0V CF=0. 000 DF=0.000 CID@30.0 (445.0000->321.1000) BY03.d 强力霉素 2.12.22.32.42.52.62comm8vs.采集时间3.43.53.63.73.83.9 +ESI MRM Frag=150. 0V CF=0. 000 DF=0.000 CID@29.0 (425.0000 -> 126.2000) BY. d 克林霉素 0.20.40.60.811.21.41c8mh深集时尚3.23.43.63.844.24.4 0.20.40.60.811.21.41c8m??时尚3.23.43.63.844.24.4 +ESI MRM Frag=160. 0V CF=0. 000 DF=0.000 CID@29.0(734.0000->158.1000) BY. d 红霉素 0.20.40.60.811.21.41c8mkt角深巢时i83.23.43.63.844.24.4 +ESI MRM Frag=215.0V CF=0. 000 DF=0.000 CID@41.0 (772.0000 ->109.1000) BY. d 吉他霉素 5.方法可行性验证 5.1基质效应验证 取纯净水样，按照上述的样品处理步骤后，氮吹至近干，加入标准使用液(1mg/L， 100 uL)， 定容成1mL， 供 LC/MS-MS检测。如果基质加标浓度准确，则可以直接用标准曲线对样品进行定量；如果不准确，请使用基质加标做曲线进行单点定量。 选择定量离子的峰面积作为纵坐标，浓度作为横坐标，做相关曲线，曲线为线性回归，各点权重相等，拟合出工作曲线，要求 R’>0.99；此曲线两周需要重新配置一次。 表-2.纯净水样的加标回收率及 RSD 值(100ng/L) 化合物 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 平均回收率 样品-1 样品-2 样品-3 样品-4 Average RSD(%) (Compound) Sample-1 Sample-2 Sample-3 Sample-4 Recoveries (%) 四环素 90.08 95.33 77.90 73.11 84.10 12.30 土霉素 107.41 93.89 78.81 94.35 93.61 12.49 金霉素 112.01 111.00 96.73 89.16 102.23 10.92 强力霉素 107.40 103.62 108.19 108.92 107.03 2.20 林可霉素 120.33 118.83 96.95 97.75 109.72 11.85 克林霉素 85.80 97.58 79.43 80.03 85.71 9.82 化合物 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 平均回收率 样品-1 样品-2 样品-3 样品-4 Average RSD(%) (Compound) Sample-1 Sample-2 Sample-3 Sample-4 Recoveries (%) 替米考星 (pH4.3) 94.00 107.04 95.95 79.12 94.03 12.21 红霉素 120.17 97.93 98.26 107.81 106.04 9.88 泰乐霉素 106.58 98.01 95.01 92.99 98.15 6.10 吉他霉素 90.69 93.19 80.12 90.29 88.57 6.53 罗红霉素 91.45 108.84 97.82 92.18 97.57 8.23 交沙霉素 106.02 93.22 102.22 84.97 96.61 9.76 螺旋霉素 75.18 68.01 67.98 71.22 70.60 4.83 6.结果与讨论 6.1对于大环内脂及四环素化合物在水中的富集方法，应考虑实验过程中基质对化合物检测的干扰。此步的干扰不仅来自于水样中杂质干扰，同时商业化的固相萃取小柱，使用的色谱级溶液等等都存在干扰杂质，因此需要进行基质效应确认，以避免前处理富集过程中存在基质效应。 6.2固相萃取柱若为 500 mg/6 mL 的型号，进 7.仪器优势 睿科 Fotector plus 在高精度注射泵的机械式移动进行活化、正压上样、淋洗和洗脱，自动化地同时同步骤运行6通道，12通阀进行8个溶剂通道的切换，无需手动更换溶剂，具有自定义的清洗上样针命令，能保证整个流程的精确性、平行性、高效性和可靠性；同时，其样品架和收集架与 Auto EVA-60能完美兼容，实现样品前处理步骤的完美连接。 行吹干小柱步骤时应延长时间至20 min。最终洗脱液的氮吹浓缩过程中应控制吹干程度，不可过分干燥。 6.33需用 10 mL 的水溶液进行淋洗，利于将固相萃取小柱中残留的 EDTA 除去，避免其在后续的洗脱液中干扰沙星类化合物的检测。 Auto EVA-60全自动平行浓缩仪可一次性平行浓缩60位样品，处理样品通量高操作；F；可智能判断浓缩过程，氮吹针自动跟随浓缩液面下降，浓缩效率高，消耗氮气量少；具有可视玻璃设计，可实时观察浓缩状态；进行针座模组和管架的替换，即可实现80 mL大体积氮吹，操作简单便捷。 邮箱： info@raykol.com热线：址：： www.raykol.com 网址：： www.raykol.com 邮箱： info@raykol.com热线： SZDB/Z 323-2018 水产品养殖水中21种磺胺类、氯霉素类、四环素类、硝基呋喃类、喹诺酮类和孔雀石绿的测定高效液相色谱-串联质谱法