农产品中农残检测方案(气相色谱仪)

thermoscientific slope of calibration curve standard in matrixME(%)=-x100slope of calibration curve standard in solvent 仅用于研究目的。不可用于诊断目的。 ◎2018 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 分析保护剂在常规农残分析检测中的应用 邢江涛王申赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词： 分析保护剂 ， Analyte Protectants，农残 1.前言 分析保护剂(Analyte Protectants，以下简称AP)，能够有效解决GC/GCMS在常规农残分析检测中因基质效应(Matrix Ef-fects)导致的诱导增强效应、峰形拖尾、灵敏度差、重现性差以及线性差等问题，不必频繁维护仪器，进而提高分析通量。添加AP具有极高的实用价值，现已成为欧盟等国际法规中推荐的抑制基质效应的有效方法之一。而我国农残常规检测领域，AP普及度不高，基质效应问题并未引起足够的重视，且不能有效简便的解决。文章通过综述前人研究成果，并结合赛默飞的气相色谱、、4气质联用仪以及气质超高分辨质谱联用仪，对添加AP进行了进一步的验证和讨论，为检测工作者提供了更好更便捷的农残分析检测解决方案。 图1基质诱导增强效应 基质效应，除了因基质干扰导致在色谱或检测器上发生的目标物与干扰物分不开的现象外，对于GC/GCMS而言，主要是指目标物与系统内活性吸附位点相互作用而导致的基质诱导增强的现象。Jana Hajslova等人在2003年对基质效应做了较为全面的阐述1。图1是对基质诱导增强效应简单的说明。 基质诱导增强效应无法避免。因为完全惰化的系统并不存在。即使采用超高惰化的衬管与色谱柱，也会因基质中非挥发性成分在系统积聚而产生新的活性吸附位点。Ana Lozano等人采用ME(%)来评估基质诱导增强效应(图2)， 并采用ExactiveGCTM超高分辨气质联用仪对婴幼儿食品中农残的基质效应做了进一步研究2，结果见表1。 图2ME计算公式 表1婴幼儿食品ME计算结果(%) Solvent Apple/pear Peach/banana Six-fruit Linear Linear Linear Linear Compound ninge，mg/kg Slope range， R mg/kg Slope R’ ME. range.mg/kg Slope R ME. range，mgkg Slope R’ ME.% Aldrin 0001-02 46492 1.0000 0.001-0.2 66495 0.9992 43 0001-02 637960.9996 37 0001-02 62418 0.9997 34 Cadusafos 0.001-02 62462 0.99980.001-0.2 153014 0.9989 145 0.001-02 1344241.0000 115 0.001-0.2131710 0.9995 111 Dieldrin 0.003-02 18813 0.99990.003-0.2 32910 0.9996 75 0.003-02 281420.9999 50 0.003-0.229548 0.9983 57 Disulfolon 0.003-02 5029 0.9988 0.001-0.2 60392 0.9991 1101 0001-02 368920.9993 634 0.001-0.2： 34633 0.9967 589 Disulfoton- 0.001-02 521883 1.00000.001-0.2 1094370.9993 110 0.001-0.2 980440.9994 88 0.001-0.2 99985 0.9984 92 sutfone Disulfoion： 0.001-02 52661 0.99950.001-0.2 1158150.9997 120 0.001-0.2 1456380.9985 177 0.001-0.2 155272 0.9998 195 sulfaxide Endrin 0003-02 12307 1.00000.003-0.2218520.9995 78 0003-02 209650.9994 70 0.003-0.220515 0.9999 67 Ethoprophos 0.001-0.2 51309 0.9996 0.001-0.2 1321100.9979 157 0.001-0.2 1148580.9999 124 0.001-0.21244090.9985 142 Fipronl 0001-02 18185 0.99980.001-02 3243870 0.9992 141 0001-02 381660.9993 110 0.001-0235995 0.9991 98 Fipronil- 0.001-0.2 31940 0.9997 0.001-0.2 77395 0.9985 142 0.001-0.2 721270.9999 126 0.001-0.264779 0.9993 103 desulfinyl HCB 0.001-02190045 1.0000 0.001-0.2248186i0.9990 31 0.001-022326300.9998 22 0.001-0.22428700.9989 28 Hoptachlor 0.001-02 48059 1.00000.001-0.2 73280 0.9994 52 0.001-0.2 722920.9999 50 0.001-0.2 69012 0.9995 44 trans- 0.001-02 20744 0.99980001-02 30049 09992 45 0001-02 283970.9989 37 0.001-0.2 28540 0.9996 38 Heptachlor epooide Nitrofen 0.001-02 17681 1.00000001-0.2 38060 0.9991 115 0001-02 350510.9998 98 0.001-02： 333250.9981 88 Terbufos 0.001-02 58868 0.9998 0(.001-0.2 159362 0.9992 171 0.001-0.2 1365970.9999 132 0.001-0.2 1329760.9993 126 。Positive values of MEs meain enhancement of the signal. In all cases.residuals of the calibration curve were below 16%. 结果显示，不同化合物在不同基质中的基质效应强度并不相同，个别组分ME%大于500%，即采用溶剂配制的标曲工作液定量样品，其定量结果及回收率往往会被放大至少5倍左右。 另一方面，因为与活性吸附位点的相互作用，一些特殊化合物(含-P=O的有机磷酸酯类含-O-CO-NH-的氨基甲酸酯类、含-OH的羟基化合物以及含R-NH-的氨基化合物等)则会出现峰形拖尾、线性差及重现性差等问题3。 图3特殊化合物因基质效应导致的问题 空白基质匹配标曲、标准加入法及稳定同位素内标法是抑制或消除基质效应的有效技术。其中空白基质匹配标曲应用更为广泛。但这三种技术均需要额外的人力成本和经济成本，并且可能因为基质的不同、抑制或消除效果的差异导致定量不准确。 AP， 最早以“掩蔽试剂( Masking Reagents)”概念，由美国农业部Ronald Erney博士与韦恩州立大学Colin F. Poole于1993年提出，旨在抑制或降低农残与GC系统内的活性吸附位点的相互作用4。不过在其研究的8种掩蔽试剂中，并未取得预期的结果。2003年， QuEChERS发明人之一Michelangelo Anas-tassiades博士在其研究基础上，进一步评价了90多种不同的化合物，目的是找到能够与活性吸附位点发生强烈作用，实现目标物的响应增强，且不产生诸如分解或污染系统等不良影响的化合物5。Anastassiades博士将这类物质命名为“分析保护剂(Analyte Protectants)”。测试的化合物中，L-古洛糖酸内酯提供了最高的整体增强。为了覆盖更宽的洗脱范围，应对各种复杂基质的基质效应，Anastassiades博士在2005年的进一步研究中，评估了AP的多种不同组合，最终提出适用于农残常规检测的最有效、经济且简便的组合6。 ；AP具有如下特点： ：1.富含羟基或氨基 2.易挥发； 3.多种AP组合优于单种AP 5.经济便宜，易获取； 6.EI源下，碎片离子质量数小，不易产生干扰； 相比空白基质匹配标曲、标准加入法及稳定同位素内标法三种方法，无论是人力成本、经济成本，又或是实际效果，分析保护剂均体现出了极高的实用价值7。截止目前， SANTE/11813/2017法规中提出添加分析保护剂可作为抑制或消除基质效应的有效手段8。 图4 EURL-SRM (EU Reference Laboratories for Residues of Pesticides)技术文件 Abundanoe 图5基于图3试验，添加分析保护剂后的改善结果 3.AP配制方法 为了进一步降低成本，提高方法的便捷性与实用性，在不影响试验结果的条件下，结合赛默飞关于农残检测的方法包，同时参考国内农残常规检测的实际情况，在EURL-SRM (EU Refe-rence Laboratories for Residues of Pesticides)技术文件基础上，进行了简单的修改。 表2AP配制方法 EURL-SRM方法 赛默飞推荐方法 步骤一50mg/mL的Sorbitol溶液，记为A 同前 步骤二 50mg/mL的D-(-)Gluconic acid-8- lactone溶液，记为B 同前 步骤三50mg/mL的Shikimic acid溶液，记为C无 步骤四 3-Ethoxy-1，2-propanedio(无需稀释)， 记为D 无 步骤五 1mLA+ 2mL B +1mL C +2g D，定容 2mLA+4mL B， ，定 至10mL 容至10mL 每1mL样品或标品，添加30pL混合AF 每1mL样品或标品， 图6常见AP在农残方法包下的覆盖洗脱范围 。注： Shikimic acid 主要是为了降低诸如克菌丹，灭菌丹及百菌清等对碱敏感农药的降解。 实验结果和讨论 1基于NY761-2008的气相色谱法(赛默飞Trace 1310 GC) NY761-2008因前处理简单，方法灵敏度高而被广泛采用。但往往因基质种类繁杂，且较为简单的前处理方式，会造成基质在系统内积聚而进一步形成活性吸附位点，从而影响分析测定 图7未添加分析保护剂的标品色谱图 图8添加分析保护剂的标品色谱图 图7和图8比较可知，添加分析保护剂对于氧乐果及乐果峰形及灵敏度有极大改善。 表3添加分析保护剂的溶剂标与苹果基质匹配标响应对比 进祥序号 进祥名称所负峰： 类型 保留时间 min 样品里 相对峰面积 % 峰面积 pA*min 峰高 pA BackDetecto BackDetector BackDetectoi BackDetector BackDetecto 氧乐果 氧乐果 氧乐果 氧乐果 氧乐果 1011 0.02+保护剂0.04 校正标准品校正标准品 17.88017.882 0.02400.0365 46.13 44.57 0.4862 0.9291 9.60 20.63 12 0.08 校正标准品 17.877 0.0797 48.21 2.4578 51.97 13 0.16 校正标准品 17.875 0.1590 49.15 5.2632 111.49 14 0.32 校正标准品 17.870 0.3208 49.97 10.9902 231.15 15 未知 n.a n.3. n.a. n.a. n.a. 16 0.02基质 未知未知 17.877 0.0263 41.64 0.5683 11.66 17 0.04基质 未知 17.877 0.0451 45.88 1.2316 25.09 18 0.08基质 未知 17.872 0.0790 47.11 2.4311 51.53 19 0.16基 未知 17.872 0.1602 48.00 5.3082 104.59 20 0.32基质 未知 17.867| 0.3082 47.71 10.5447 207.24 数据结果表明，对于苹果基质而言，添加分析保护剂的溶剂标与基质匹配标响应几乎一致，可有效消除基质效应。 2血液中农药残留测定(赛默飞ISQ 7000 & TSQ 9000) 在公安刑侦行业，样品的获取、保存及分析时效性是分析检测的重要挑战。往往血液样品经过简单的液液萃取并过滤后直接上机分析。样品中的基质会在衬管及色谱柱内积聚，形成新的吸附位点，并且造成系统过快污染，从而影响重现性及分析通量。以下是有无分析保护剂的对比结果。 图9未添加分析保护剂的血样中甲胺磷、敌敌畏、乙酰甲胺磷及毒鼠强 图10添加分析保护剂的血样中各组分色谱图 表4分析保护剂对血样精密度的影响(n=8*3d，，*为添加AP溶液) 第一天 第二天 第三天 连续三天 第一天* 第二天* 第三天* 连续三天* 3果蔬中多农残的筛查与定量(赛默飞Exactive GC) 应用Exactive GC可同时完成多农残的筛查与定量。与三重四极杆气质联用仪不同的是， Exactive GC为高分辨率、高质量精度的全扫描数据，不需要额外的方法编辑，不受数据库化合物数目的限制，具有高灵敏度，高度选择性及可追溯性等特点。 赛默飞Exactive GC气质超高分辨质谱在分辨率R=60000(m/z200)下，全扫描的选择性可媲美三重四极杆气质联用仪的SRM扫描(见图11)。 图11混合果蔬基质中150种农残IDL对比 为了进一步验证添加AP对方法耐用性及分析通量的改善，选取葡萄作为基质，采用Quechers方法做前处理，依照每10个样品+1个质控样(空白基质加标100ppb)(添加100ppb)为一个循环，共循环进样30次，共计300余针(未更换衬管，未清洗离子源)。计算30针质控样结果的RSD值。结果如下： 图1250种农药RSD分布图 表550种农药清单 Methamidophos Vinclozoline Isofenphos-methyl Permethrin Dichlorvos Parathion-methyl Fipronil Pyraclostrobine Acephate Metalaxyl Pendimethalin Pyridaben Etofenprox Fenitrothion Procymidone Cypermethrin Phorate Malathion Paclobutrazol Flucythrinate BHC， alpha Chlorpyrifos Profenofos Fluvalinate Dimethoate Phorate sulfone Chlorfenapyr Fipronil sulfone BHC， beta Parathion Triazophos Difenoconazole Quintozen Phorate sulfoxide Iprodione Cyfluthrin BHC， delta Triadimefon Bifenthrin Deltamethrin Diazinone Isocarbophos Fenpropathrin Fenvalerate BHC， gama Dicofol Phosalone Fipronil desulfinyl Fipronil sulfide Cyhalothrin 结论 1.分析保护剂已被证明能够有效解决GC/GCMS在常规农残分析检测中因基质效应导致的诱导增强效应、峰形拖尾、灵敏度差、重现性差以及线性差等问题，不必频繁维护仪器，进而提高分析通量。添加AP具有极高的实用价值，现已成为欧盟等国际法规中推荐的抑制基质效应的有效方法之一。 2.结合赛默飞农残分析方法包，针对性的提出了添加分析保护剂的解决方案，并分别通过GC、GCMS以及GC-Orbitrap三个案例进行了验证，结果均达到预期目的。 ( [1 ] Hajslova， J. a nd J. Z r ostliková (2003). "Matrix effe c ts in (ult r a)trace a nalysis of pesticide r e sidues in food an d bio t ic mat r i-ces . "Journal o f ChromatographyA 1000(1-2)： 18 1 -197. ) ( [2]Lozano， A.， e t al. (2018). "Pesticide Residue Analysis in Fruit-and V egetable-Based Baby F o ods Using GC-Orbitrap MS." JAOAC Int 1 01(2)： 374 - 382. ) ( [3]Kater ina Mastovska'， S . J . L.， and M ichelangelo A n astassia-des ( 2005). "Combination of Analyte Protectants To OvercomeMatrix E ffects in Routine GC Analysis of Pesticide Residues in Food Matrixes." Anal. Chem. 77：8129-8137. ) ( 热线800 8105118 电话4006505118 www.thermofisher.com ) ( [4] Erney， D. R. (1993). "A Study of Single Compound A d ditives t o Minimize the Matrix Induced Chromatographic ResponseEnhancement Observed in t h e Gas C h romatography of Pesti-cide Residues." Journal of High Resolution Chromatography 16：501-503. ) ( [5] Anastassiades， M.， et al. (2003). 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