新生儿足跟血干血斑中氨基酸，肉碱，琥珀酰丙酮检测方案(液质联用仪)

SSL-CA19-039Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-396 LCMS-8050 CL用于新生儿筛查稳定性的应用研究 LCMSMS-396 摘要：本研究使用珀金埃尔默新生儿筛查试剂盒在岛津 LCMS-8050 CL 上进行稳定性考察实验，实验结果显示，所有氨基酸、琥珀酰丙酮及肉碱质控品的测定结果均在试剂盒要求的质控范围内(质控范围为靶值±3SD)。5天测定的90批次质控分析数据，超过 99.5%的高低质控数据落在靶值±2SD以内，高浓度质控数据超过95%落在靶值±1SD以内，低浓度质控数据超过87%落在靶值±1SD以内，远优于试剂盒规定的质控范围为靶值±3SD。 LCMS-8050 CL 液系统用系统进行新生儿筛查检测灵敏度、精密度及稳定性优异，能够满足临床新生儿筛查检验需求。 新生儿筛查(newborn screening， NBS) 是指一些目前还无法在产前作出诊断的先天性疾病，在新生儿期间取少量血液进行快速地检查，从而来判别新生儿是否患有遗传性的疾病。其目的是对那些患病的新生儿在临床症状尚未表现之前或表现轻微时通过筛查，得以早期诊断、早期治疗，防止机体组织器官发生不可逆的损伤。避免患儿发生智力低下、严重的疾病或死亡。 新生儿筛查发展史上最重要的进展。。它主要通过数十种小分子的分析，筛查出包括氨基酸病、有机酸代谢紊乱和脂肪酸氧化缺陷在内的几十种遗传代谢病，大大提高了筛查效率，实现了“一种实验检测一种疾病”到“一种实验检测多种疾病”的转变。 本文应用非衍生化样本处理的串联质谱技术检测新生儿足跟血干血斑中氨基酸、琥珀酰丙酮和肉碱浓度(具体分析物见表1)，用以考察 LCMS-8050 CL 进行新生儿筛查检测准确度、灵敏度及稳定性。 表1检测分析物 编号 氨基酸 缩写 丙氨酸 Ala* 2 精氨酸 Arg 3 瓜氨酸 Cit* 4 甘氨酸 Gly* 5 亮氨酸/异亮氨酸/羟基脯氨酸 Leu/lle/Pro-OH* 6 蛋氨酸 Met* 7 鸟氨酸 Orn 8 苯丙氨酸 Phe* 9 脯氨酸 Pro* 10 酪氨酸 Tyr* 11 缬氨酸 Val* 12 琥珀酰丙酮 SA* 注：：*为质控分析物 I实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津临床用超高效液相色谱仪 LC-30A CL 与三重四重杆质谱仪 LCMS-8050 CL 用用系统。具体配置为 LC-30AD CL×2(输液泵))，DGU-20A5RCL(在线脱气机)， SIL-30ACMP CL (自动进样器)，CTO-30A CL (柱温箱)， CBM-20ACL 系统控制器， LCMS-8050 CL三重四极杆质谱仪，LabSolutions Ver. 5.91色谱工作站， Neonatal Solution Ver. 2.30新生儿筛查工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱：无，安装在线过滤器，珀金埃尔默试剂盒提供 流动相：珀金埃尔默试剂盒提供 流速：0.15mL/min 柱温：室温 进样量：1uL 自动进样器温度：4℃ 洗脱方式：流速梯度，时间程序见表2。 表2流速梯度时间程序 Time(min) Module Command Value 0.10 Pumps Total flow. 0.05 0.65 Pumps Total flow.. 0.30 0.66 Pumps Total flow. 1.00 1.00 Controller Stop 质谱条件： DL温度 ：300℃ 分析仪器：：： LCMS-8050 CL离子源 ： ESI(+) 加热模块温度：450℃雾化气流速：3.0L/min 干燥气流速 ：5.0L/min加热气流速：15.0L/min 扫描模式 ：多反应监测(MRM) 接口温度 ：300℃ 1.3材料与方法 1.3.1材料 高质控干血斑：珀金埃尔默试剂盒提供 低质控干血斑：珀金埃尔默试剂盒提供 内标准溶液：珀金埃尔默试剂盒提供 样品稀释液：珀金埃尔默试剂盒提供 1.3.2方法 方法原理：使用含稳定同位素标记的氨基酸、琥珀酰丙酮及肉碱内标准品的溶剂萃取滤纸干血片中的氨基酸、琥珀酰丙酮及肉碱，然后用MS/MS系统进行分析。通过测定每个氨基酸、琥珀酰丙酮及肉碱与其对应的同位素内标的离子峰强度，由已知水平的内标，即可通过岛津新生儿筛查软件自动计算出所测样本的氨基酸、琥珀酰丙酮及肉碱浓度水平。 样本前处理方法：用直径3mm打孔器在滤纸血片上取样，置于96孔板中，每孔加入含氨基酸、琥珀酰丙酮及肉碱同位素内标的溶液100uL， 45℃密封孵育震荡(650~750 r/min) 45 min， 提取75 uL萃取液转移至Ⅴ型底96孔板内，铝膜覆盖，上机检测，如图1所示。每天分别制备5批次低浓度质控(LC)，5批次高浓度质控(HC)进行测定，每个批次重复进样3针，第二天重新测定第一天制备质控品，并重新制备5批次低浓度质控，5批次高浓度质控进行测定，如此连续续定5天，共进样270针样品。 图1样本前处理及分析流程 |实验结果 质控品测定谱图见图2，9种氨基酸质控品、琥珀酰丙酮及13种肉碱质控品测定稳定性结果见图3及表3。 图2质控品测定谱图 LCLeu 12 HC Leu S50 45 350 250 50 HC C4 A恤WA wwMW * MANMAL .1 95 图3质控品连续5天测定结果 表3.连续五天测试质控数据统计结果 分析物 ±1SD以内占比/% ±2SD以内占比/% ±3SD以内占比/% LC HC LC HC LC HC Ala 76.3 99.3 100 100 100 100 Cit 93.3 93.3 100 100 100 100 Gly 91.9 97.8 100 100 100 100 Leu 96.3 99.3 100 100 100 100 Met 83.7 88.1 100 99.3 100 100 Phe 91.9 100.0 100 100 100 100 Pro 92.6 100.0 100 100 100 100 86.7 97.0 99.3 100 100 100 98.5 100.0 100 100 100 100 Sa 55.6 72.6 92.6 100 100 100 C0 97.0 99.3 100 100 100 100 C2 91.1 99.3 100 100 100 100 C3 88.9 98.5 100 100 100 100 C4 89.6 98.5 100 100 100 100 C5 83.7 97.8 100 100 100 100 C5DC 71.9 89.6 98.5 100 100 100 C6 77.0 98.5 100 100 100 100 C8 93.3 98.5 100 100 100 100 C10 90.4 99.3 100 100 100 100 C12 88.1 98.5 100 100 100 100 C14 94.1 96.3 100 100 100 100 C16 92.6 99.3 100 100 100 100 C18 89.6 97.0 100 100 100 100 |结果与讨论 本研究使用珀金埃尔默新生儿筛查试剂盒在岛津LCMS-8050 CL上进行测定稳定性考察实验，实验结果显示，5天测定的所有氨基酸、琥珀酰丙酮及肉碱质控品的测定结果均在试剂盒要求的质控范围内(质控范围为靶值±3SD)。其中，5天测定的90批次质控数据(每批次重复3针进样，质控品中含有23个质控分控物)，超过99.5%的高低质控数据落在靶值±2SD以内， 高浓度质控数据超过95%落在靶值±1SD以内，低浓度质控数据超过87%落在靶值±1SD以内，远优于试剂盒的规定。使用 LCMS-8050 CL 液质联用系统进行新生儿筛查检测灵敏度及精密度良好，稳定性优异，能够满足临床新生儿筛查检验需求。 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心 Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center ( 上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996 http：//www.shimadzu.com.cn Build ing C 8 01， N o. 1 80 Yizhou R o ad， S h a ng h a i Hotline ： 021-3419 39 96 ) LCMS-8050 CL上进行稳定性考察实验，实验结果显示，所有氨基酸、琥珀酰丙酮及肉碱质控品的测定结果均在试剂盒要求的质控范围内（质控范围为靶值±3SD）。5天测定的90批次质控分析数据，超过99.5%的高低质控数据落在靶值±2SD以内，高浓度质控数据超过95%落在靶值±1SD以内，低浓度质控数据超过87%落在靶值±1SD以内,远优于试剂盒规定的质控范围为靶值±3SD。LCMS-8050 CL液质联用系统进行新生儿筛查检测灵敏度、精密度及稳定性优异，能够满足临床新生儿筛查检验需求。