正常人和临床病人尿液中砷形态检测方案(液相色谱仪)

SSL-CA20-187Excellence in Science Excellence in ScienceICPMS-146 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD.- Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn HPLC-ICP-MS 法测定临床病人尿液中的形态砷 ICPMS-146 摘要：本文建立了 HPLC-ICP-MS 测定临床病人尿液中四种有毒形态砷的分析方法。尿液经过稀释后，采用高效液相色谱 LC-20Ai 对形态砷进行分离，电感耦合等离子体质谱 ICPMS-2030 进行定量分析。在1.0~100.0ng/mL范围内，各种形态砷的线性相关系数大于0.99996，加标回收率在92.4%~109.0%之间，浓度和保留时间精密度(n=3)分别小于3.0%和0.3%。方法检出限在1.42-1.86 ng/mL 之间，该方法可应用于正常人尿液、接受砷剂治疗的患者尿液和其他砷中毒患者尿液中砷形态的分析。 砷是致癌物质，长期低剂量接触会引起皮肤癌、膀胱癌和肺癌，同时引发神经系统和心血管系统疾病。砷的毒性与其存在形态密切相关，在常见砷的化合物中，亚砷酸盐 (As (III))和砷酸盐(As(V))毒性较大，一甲基砷酸(MMA)和二甲基砷酸((DMA)毒性较小，砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱 (AsC) 和砷糖等基本没有毒性。 砷在生物体内会发生代谢、转化、使得砷的形态变得复杂。大量的研究表明，人体经砷暴露后，无机砷(As(Ⅲ)和As(V))在体内经过甲基化和还原过程，产生多种甲基化代谢产物，随后经尿液排出。尿液是易获得的检材，且尿砷是一种较理想的反映近 期砷暴露的生物学标志。然而砷化合物的毒性各不相同，总砷含量常常不能正确反映人体经暴露后的代谢情况，所以对不同形态、价态的砷化物进行测定显得尤为重要。 本研究将尿液直接使用20 mmol/L EDTA-2Na(含0.1%的曲拉通)稀释。采用岛津高效液相色谱LC-20Ai与电感耦合等离子体质谱仪ICPMS-2030联用对临床病人尿液中砷进行形态分析，定量分析各个形态砷的含量。本方法操作简便，可应用于正常人尿液、接受砷剂治疗的患者尿液和其他砷中毒患者尿液中砷形态分析。 实验部分 1.1对照品 砷酸、亚砷酸、一甲基砷、二甲基砷、砷胆碱、砷甜菜碱购于国家标准物质中心。 1.2实验检材 正常人和临床病人尿液 1.3仪器 本实验使用岛津高效液相色谱仪 LC-20Ai 与电感耦合等等子体质谱仪 ICPMS-2030联用系统。具体配置为LC-20Ai×2输液泵， DGU-20A3在线脱气机， SIL-20AC自动进样器， CTO-20AC柱温箱， CBM-20A系统控制器，ICPMS-2030电感耦合等离子体质谱仪，LabSolutions ICPMS TRM 工作站； AP135W电子天平(日本岛津公司)；Allegra 25R 低温高速离心机(美国Beckman) 。 1.4试剂 乙二胺四乙酸钠 (EDTA-2Na)、曲拉通及碳酸铵均为优级纯，甲醇为色谱纯。 方法和结果 2.1标准溶液配制 精密吸取对照品储备溶液适量，加20 mmol/L EDTA-2Na (含0.1%的曲拉通)溶液制成每1mL各含1.0 ng、4.0 ng、10.0 ng、20.0 ng、50.0 ng、100.0ng(均以砷计)系列浓度的混合溶液，摇匀，备用。 2.2样品前处理 将尿样用 20 mmol/L EDTA-2Na(含0.1%的曲拉通)溶液稀释20倍后进 HPLC-ICP-MS分析。 2.3色谱条件 色谱条件参见表1、表2。 表1 HPLC分析条件 参数 参数设定 色谱柱 Dionex lonPacTM AS19 7.5 um 250*4 mm 流动相 A-50 mmol/L 碳酸铵水溶液 ( (pH=9) B-水 流速 1.2 mL/min 柱温 30°℃ 进样量 20pL 洗针液 水 洗脱程序 梯度洗脱 梯度洗脱条件 表2 梯度洗脱条件 Time Flow A.Conc B.Conc 0.00 1.20 0 100.0 5.00 1.20 100.0 0 9.00 1.20 100.0 0 10.00 1.20 0 100.0 25.00 1.20 0 100.0 2.4质谱条件 ICP-MS 仪器分析条件见表3。 表3 ICP-MS分析条件 参数 参数设定 参数 参数设定 高频功率 1.20kW 等离子体气 9.0 L/min 辅助气 1.10 L/min 载气 0.70 L/min 炬管类型 Mini炬管 雾化器 同心雾化器 雾化室 旋流雾室 雾化室温度 5℃ 采样深度 5.0 mm 高频频率 27.12 MHz 碰撞气 He 碰撞气流速 4 mL/min 池电压 -21 V 能量过滤器电压 5.0V 结果与讨论 3.1专属性考察 对六种形态砷单标溶液和样品加混标溶液进样考察，排除系统干扰，并且考察六种形态砷的分离度，以确保实际样品分析过程中不会造成假阳性检出，见图1。四种有毒形态砷分离度大于1，不存在假阳性检出。 图1砷元素形态色谱图 1.砷胆碱 (AsC)+砷甜菜碱 (AsB)2.二甲基砷(DMA) 3.亚砷酸 (As(ⅢI)) 4.一甲基砷(MMA)5.砷酸 (As(V)) 3.2线性关系考察 按“2.1标准溶液配制”规定进行标准曲线系列浓度的配制，记录各成分的峰面积，以浓度(浓度均以As计)与峰面积比值做线性回归绘制标准曲线，结果如下图所示。在1.0~100.0 ng/mL范围内，四种有毒形态砷的线性相关系数大于 0.99996，线性关系良好。 图2 二甲基砷 (DMA) r=0.99999 图3 亚砷酸 (As(ⅢI)) r=0.99996 图4 甲基砷((MMA)) r=0.99998 图5砷酸 (As(V)) r=0.99998 3.3检出限考察 在进样体积为20uL时，对浓度为 1.0 ng/mL 样品溶液考察六种形态砷的信噪比，以三倍信噪比(3S/N)峰高对应浓度作为检出限，五种形态砷1.0 ng/mL 色谱图、基线及检出限结果分别见图6、7和表4. 图6砷元素形态色谱图 1.砷胆碱(AsC)+砷甜菜碱 (AsB) 2.二甲基砷(DMA) 3.亚砷酸 (As(ⅢI))4.一甲基砷(MMA)5.砷酸 (As(Ⅴ)) 图7基线 表4 检出限考察结果 目标物 中文名称 仪器检出限 方法检出限 (ng/mL) (ng/mL) DMA 二甲基砷 0.071 1.42 As(ⅢI) 亚砷酸 0.085 1.70 MMA 一甲基砷 0.093 1.86 As(V) 砷酸 0.078 1.56 3.4样品测试结果及回收率考察 对正常人和临床病人尿液样品进行 LC-ICPMS 测定，并对正常人样品进行低、中、高三个浓度级别加标回收试验，样品加标回收结果见表5，临床病人测定定果见表6. 表5 样品加标回收率 正常人测定结果 加标浓度 加标测定结果 回收率 目标物 中文名称 (ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) (%) 2.0 4.69 103.3 AsC+AsB 砷胆碱+ 砷甜菜碱 2.63 20 21.1 92.4 100 99.2 96.6 1.0 1.51 98.2 DMA 二甲基砷 0.53 10 9.9 93.7 50 48.2 95.3 1.0 1.02 102.0 As(I) 亚砷酸根 ND. 10 9.63 96.3 50 47.8 95.6 1.0 1.09 109.0 MMA 一甲基砷 ND. 10 9.34 93.4 50 47.5 95.0 1.0 1.23 103.0 As(V ) 砷酸根 0.20 10 9.63 94.3 50 48.2 96.0 备注： ND.未检出 表6 临床病人样品测定结果(ng/mL) 样品名称 AsC+AsB DMA As(Ⅲ) MMA As(Ⅴ) V-11 ND. 1094 1340 814 270 V-12 ND. 125.4 179 99.4 67.0 V-1 ND. 130.4 56.6 76.4 78.0 V-2 ND. 8.36 7.30 13.5 8.38 V-25 ND. ND. ND. 10.3 12.4 V-26 ND. ND. ND. ND. 6.42 V-27 ND. 33.2 7.16 14.4 16.3 备注：ND.未检出 3.5精密度考察 取3份样品溶液，各加入 10.0 ng/mL的6种形态砷混合标准溶液并重复3次测定，对方法学浓度和保留时间精密度进行考察，结果以RSD 表示，见表7。 表7 浓度及保留时间精密度结果(n=3) 目标物 中文名称 浓度精密度 保留时间精密度 (RSD，%) (RSD，%) AsC+AsB 砷胆碱+砷甜菜碱 1.73 0.26 DMA 二甲基砷 2.05 0.13 As(Ⅲ) 亚砷酸 2.60 0.01 MMA 一甲基砷 2.49 0.02 As(V) 砷酸 1.26 0.03 结论 本文建立了 HPLC-ICP-MS 测定尿液中四种有毒形态砷的分析方法。分析结果显示，四种形态砷在1.0~100.0 ng/mL 范围内线性关系良好，相关系数大于0.99996， 加标回收率在 92.4%-109.0%之间，浓度和保留时间精密度 RSD (n=3) 分别小于3.0%和0.3%。该方法可应用于正常人尿液、接受砷剂治疗的患者尿液和其他砷中毒患者尿液中砷形态分析。 岛津应用云 本文建立了HPLC-ICP-MS测定尿液中四种有毒形态砷的分析方法。分析结果显示，四种形态砷在1.0~100.0 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数大于0.99996，加标回收率在92.4%-109.0% 之间，浓度和保留时间精密度RSD（n=3）分别小于3.0% 和0.3%。该方法可应用于正常人尿液、接受砷剂治疗的患者尿液和其他砷中毒患者尿液中砷形态分析。