苹果汁中展青霉素检测方案(液相色谱仪)

样品制备 结论012421_CHN_01 PKI 利用UHPLC：(配置紫外检测器)分析苹果汁中展青霉素 简介 展青霉素(结构如图1所示)是一种由青霉、曲霉和丝孢霉等霉菌产生的真菌毒素类有毒物质，常见于水果、蔬菜、奶 酪和谷物中。展青霉素污染在 受损水果中最常见，这些水果通常用于生产果汁、馅饼和蜜饯；由于在发酵过程中被抑制，因此酒精饮料或醋类产品中通常不存在展青霉素。1展青霉素一直是苹果汁加工中的一个重要问题，由于其热稳定性，巴氏消毒过程中展青霉素的分解受到抑制。因此，妥善装运和储存水果对于预防产生展青霉素的霉菌来说十分重要。 虽然不被认为是一种特别致命的毒素，但各种研究表明展青霉素具有遗传毒性，所以某些人们认为展青霉素是一种致癌物质。根据动物研究中展青霉素的副作用，美国食品药品监督管理局(FDA)认为，在一定暴露水平下，展青霉素可能对人体构成安全风险。1在制定展青霉素的干预水平时， FDA 将人群分为三组，主要针对儿童，因为幼儿可能摄入相对于体重更多的苹果汁。然而，截至目前 FDA 并未针对单个人群确定任何水平限值，仅规定通用最大限最为 50ug/kg (50ppb)。? 欧盟(EU) 同样依据动物研究的科学数据做出决定，并根据第1425/2003号欧委会条例(EC)建议苹果汁和苹果食品中展青霉素的最大摄入限值为 50ug/kg (50ppb)。在酒精饮料和苹果酒等其他饮料中，建议的限值也为50ug/kg。针对苹果泥等固体苹果食品，建议的限值为25pg/kg (25ppb)。然而，针对婴儿或幼儿食用的任何苹果食品，限值为 10ug/kg (10ppb)。3 展青霉素检测的常规方法采用多步液液萃取(LLE)技术，而最近开发的方法采用 SPE (固相萃取技术)。然而，许多方法需要进行多步骤样品制备，有些方法则需要使用大量的溶剂和化学品。4，5因此，本研究的重点是开发一种简单、稳健、可靠的液相色谱方法，用于分析苹果汁中的展青霉素。 文中阐述了方法条件和性能数据，包括线性和重复性。 图1.展青霉素的化学结构和特性。 实验 硬件/软件 使用 PerkinElmer AltusTMUPLC@ 系统进行色谱分离，其中包括 Altus A-30 溶剂/样品模块、一体式真空脱气装置、A-30柱温箱和 Altus A-30 紫外检测器。所有仪器控制、分析和数据处理均采用 Waters@Empower 3色谱数据软件 (CDS)平台完成。 方法参数 液相色谱参数如表1所示。 液相色谱柱： PerkinElmer BrownleeM HRes DBAQ C181.9um，2.1×100mm(货号：N9303919) 流动相： 流动相：99：1水/甲醇；预混合 分析时间： 5 min. 流速： 0.55mL/min. 压力： 9900 psi/660 barr((最大值) 柱温箱温度： 35℃ 检测： 275nm 进样量： 5uL 采集(数据)速率： 5 pts./sec 备注：每进样50次后，建议用乙腈和水的混合物(50/50)冲洗色谱柱30min。 溶剂、标准品和样品 所用溶剂、试剂和稀释剂为 HPLC 级或 ACS 级，并利用0.45um 滤膜过滤。用水作稀释剂，利用冰醋酸将 pH 值调节到4.0。展青霉素标准样品选自美国密苏里州圣路易斯市的Sigma-Aldrich@Inc.. 实验 标准品制备 通过称取5mg 展青霉素标准品至25mL 容量瓶中并用乙酸乙酯稀释至刻度来制备 200pg/mL 的展青霉素储备液。通过移液管吸取0.6mL 储备液至25mL 容量瓶中并稀释至刻度来制备4.8ug/mL 的工作液。使用前，储备液和工作液均需避光冷藏保存，以保持稳定性。4 为测定保留时间的重现性，通过量取 75uL 储备液至 50mL容量瓶并稀释至刻度来制备 0.3ug/mL的展青霉素标准溶液。 对于校准曲线所用校准液，利用稀释剂连续稀希工作液制备，各校准液浓度如表2所示。 针对加标苹果汁中展青霉素的校准曲线，通过量取 25uL 储备液至5mL容量瓶中并稀释至刻度来制备 1.00ug/mL 展青霉素加标苹果汁样品。随后通过连续稀释 1.00ug/mL 的加标样品制备后续浓度水平的溶液。所有校准液需涡旋30秒并用0.45um 尼龙过滤器进行过滤。针对加标苹果汁，各校准液浓度如表3所示。各校准液进样三次。 表2.各校准水平的展青霉素浓度。 校准水平 展青霉素浓度 (ug/mL) 1 0.0048 2 0.0096 3 0.0191 4 0.0382 5 0.0955 6 0.1910 两份苹果汁分别标记为苹果汁A和苹果汁B，购自当地商店。额外两份样品分别标记为苹果汁C 和苹果汁D，由果汁加工厂提供。 使用表1中的方法参数，表2显示了三分钟内展青霉素的保留时间。 对所有果汁样品进行分析，不使用时冷藏保存。 图2.所制备的 level-2 校准液 (0.0096ug/mL) 色谱图；紫外波长 275nm。 图3显示了0.3pg/mL标准品12次重复进样的叠加谱图，展现出良好的重现性。展青霉素保留时间 (RT) 精密度为 0.028%RSD 图4显示了展青霉素的校准曲线，展现出良好的线性拟合(R2=0.99990；n=3)。分析了两种购自商店的苹果汁 A 和苹果汁B中是否存在展青霉素。如图5所示，两份样品中均未 检测到展青霉素。为确定分析物的预期洗脱时间，利用0.3ug/mL 的展青霉素标准品对各样品的色谱图进行重叠比较。 图4.稀释剂中展青霉素的6级校准结果。 图5.苹果汁A和苹果汁B(黑色)以及 0.3ug/mL 展霉霉素标准品(红色)的色谱图。 为进一步确定方法在含有展青霉素实际样品基质中的适用性并验证回收率，通过在苹果汁A中加入不同量的 200ug/mL储备溶液，创建了5个水平的校准液，得到的浓度如表3所所。每份校准液涡旋30秒，在进样前用 0.45um 尼龙过滤膜进行过滤。所有校准液重复进样三次。 校准水平 加标浓度 (ug/ml) 1 0.02 2 0.10 3 0.25 4 0.50 5 1.00 图6显示了 Level1 (0.02ug/mL) 加标苹果汁A与0.3ug/mL 展青霉素标准品重叠谱图。展青霉素与其他基质峰有效分离。 图 6.0.02ug/mL 展青霉素加标苹果汁A(黑色)和 0.3pg/mL 展青霉素标准品(红色)的色谱重叠图。 图7显示了苹果汁A中加标展青霉素的校准结果。结果展现出良好的线性，R2=0.99932(各水平下n=3)。 1.00 针对苹果汁A中的加标展青霉素，检测限和定量限分别为0.0016ug/mL (1.6ppb) 和 0.0053ug/mL (5.3ppb)。 根据展青霉素的初始校准结果，计算了各校准水平下苹果汁A中加标展青霉素的回收率(表4)。 随后分析了选自果汁生产厂的苹果汁C和苹果汁D。如图8示，两份样品中均检测出展青霉素。各样品试验三次，计算得出的苹果汁C和苹果汁D的平均展青霉素水平分别为 0.071ug/mL(71ppb)和 0.706ug/mL (706ppb)。两个数值均符合提供者的预期。 表4.基于展青霉素初始校准结果，各加标水平下苹果汁A中展青霉素的回收率。 校准水平 展青霉素浓度(ug/mL) 展青霉素回收率(%) 1 0.02 87.2 2 0.10 78.8 3 0.25 77.3 4 0.50 79.6 5 1.00 101.8 图8.苹果汁C和苹果汁D(黑色)以及稀释剂中 0.3ug/mL 展青霉素标准样品(红色)的色谱图。 结果表明此方法可用于苹果汁中展青霉素的高效、常规、稳健的色谱分析。利用带有紫外检测功能的 UHPLC 在 5min 内将分析物与其他基质成分有效分离。结果显示在检测浓度范围内具有良好的保留时间重现性和出色的线性。因此，考虑到展青霉素5.3ppb 的定量限水平和实际样品的回收率结果，此应用能有效监测苹果汁中的展青霉素，并涵盖了欧盟针对幼儿规定的苹果汁中 10ug/kg (10ppb) 的最大许可限值。该值还远远低于 FDA 当前认可的 50ug/kg (50ppb)的一般限值。 ( 1 . U .S. Food and Drug Administration； Patulin i n Apple Juice，Apple Juice C o ncentrates a nd Apple Juice P roducts；U.S. Department of Health and Human Services.September 2001. http：//www.fda.gov/Food/ FoodbornelllnessContaminants/NaturalToxins/ucm212520.htm. ) ( 2. U.S. Food and Drug Administration； CPG Sec510.150Apple Juice， Apple Juice Concentrates， a nd Apple Juice Products- Adulteration with P atulin. http：//www.fda.gov/lCECI/ComplianceManuals/CompliancePolicyGuidanceManual/ ucm074427.htm ) ( 3. Commission of the European Community； Commission Directive 1425/2003； Amending Regulation (EC) No 466/2001 as regarding patulin. s.l. ； Offici a l Journ a l o f the EuropeanCommunity Legislation， 2 0 03. Vol. L 203， 1 - 3. ) 4. Official Method of Analysis； AOAC International. Method995.10， Gaithersburg， MD； AOAC， June 2000， Vol. 17th Edition. 5. Determination of Patulin in Apple Juice： Comparative Evaluationof Four Analytical Methods； David R. Katerere， SonjaStockenstrom， Gabriele Balducci， Gordon S. Shephard.No. 1，Tygerberg： Journal of AOAC International， 2007， Vol. 90. 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司地址：上海张江高科技园区张衡路1670号邮编：201203电话：021-60645888传真：021-60645999www.perkinelmer.com.cn 有关我公司完整的全球办事处设立情况，请访问 www.perkinelmer.com/ContactUs 展青霉素检测的常规方法采用多步液液萃取（LLE）技术，而最近开发的方法采用SPE（固相萃取技术）。然而，许多方法需要进行多步骤样品制备，有些方法则需要使用大量的溶剂和化学品。 因此，本研究的重点是开发一种简单、稳健、可靠的液相色谱方法，用于分析苹果汁中的展青霉素。文中阐述了方法条件和性能数据，包括线性和重复性。