牛奶中泼尼松龙残留检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-688Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-341 上海市徐汇区宜宜路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996http：//www.shimadzu.com.cn 超高效液相色谱三重四极杆质谱联用测定牛奶中多兽药残留 LCMSMS-341 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用测定牛奶中多兽药残留的方法。该方法使用岛津技迩 WondaPak QuEChERS 兽残专用产品对牛奶样品进行净化， Shim-pack GIST色谱柱进行分离，在 16 min 内完成 152种兽药的分析，涉及的兽药种类包括磺胺类、喹诺酮类、四环素类、硝基咪唑类、β-内酰胺类、氯霉素类、激素类、β-受体激动剂类、大环内酯类、苯并咪唑类、糖皮质激素类等22类，所得校准曲线线性良好，相关系数均在0.991以上；低、中、高不同浓度的混合标准溶液平行测试6次，152种兽药的保留时间和峰面积 RSD 分别在0.01~0.62%和0.23~13.76%之间，仪器精密度良好；配制加标浓度为 1 ng/mL、5 ng/mL 和10ng/mL 的样品进样检测，加标回收率在40.0~119.57%之间。综上所述，该方法具有分析速度快、重复性好、灵敏度高的特点，可适用于牛奶中多兽药残留同时检测。 关键词：多兽残 QuEChERS 牛奶超高效液相色谱仪三重四极杆质谱仪 在畜牧业生产、禽类饲养和水产品养殖过程中经常会使用兽药，用于疾病预防和治疗，或调节生理机能，促进生长。但大量兽药的使用，导致药物在动物体内残留，进一步通过食物链造成人体内药物蓄积，产生耐药性，严重还会导致毒性反应。为保证食品安全，我国发布了多项法规，明确了动物源食品中兽药残留的检出限量。但因兽药种类多，理化性质差异较大，相关标准中多以性质类似的化合物进行方法开发，这类方法中样本前处理周期长、步骤复杂，无法在短时间内进行多兽药残留的筛查检测。 QuEChERS 方法因高效、快速、易于操作，广泛应 用于农药检测领域。近年来，已有相关报道将该技术应用到兽药检测领域，一次处理即可完成多种兽药的筛查和检测，操作简便，提高了工作效率。 本文参考中国农业部发布的235公告《动物性食品中兽药最高残留限量》，以牛奶为基质，对规定的最大残留限量药物和禁用药物，涉及的种类包括磺胺类、喹诺酮类、β-受体激动剂类、大环内酯类、苯并咪唑类、激素类等22大类，通过QuEChERS 方法进行净化和提取，使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050联用系统，对牛奶中的多兽药残留进行检测。 实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A与三重四极杆质谱仪LCMS-8050 联用系统。具体配置为LC-30ADx2(输液泵)， DGU-20A5R(在线脱气机)， SIL-30AC( 自动进样器)， CTO-20A(柱温箱)， CBM-20A 系统控制器，LCMS-8050 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 6.81 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 流速：0.3 mL/min 色谱柱： Shim-pack GIST 2.1 mm I.D.x100 mm L.，柱温：40℃2pm进样量：10pL流动相：A相-0.1%甲酸+2 mmol/L 乙酸铵水溶液；洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为10%，洗脱B相-甲醇程序见表1 表1梯度洗脱程序 Time (min) Module Command Value 0.50 Pumps Pump B Conc. 10 3.00 Pumps Pump B Conc. 30 8.00 Pumps Pump B Conc. 70 10.00 Pumps Pump B Conc. 100 13.00 Pumps Pump B Conc. 100 13.10 Pumps Pump B Conc. 10 16.00 Controller Stop 质谱条件 离子源： ESI 加热模块温度：400℃ 雾化气流速：3.0L/min 干燥气流速：10.0L/min 加热气流速：10.0L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 接口温度：300℃ 驻留时间：10 ms DL 温度：250℃ MRM参数：见表2 表2MRM参数 名称 英文名 CAS No. 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias (V) CE(V) Q3 Pre Bias (V) 羟基甲硝唑 Hydroxymetroni 4812-40-2 188.10 126.10* -23 -16 -23 dazole 123.10 -23 -14 -22 202.10* -11 -11 -22 西马特罗 Cimaterol 54239-37-1 220.20 143.10 -26 -23 -27 226.10 152.00* -11 -16 -28 特布他林 Terbutaline 23031-25-6 125.10 -26 -23 -24 144-80-9 215.00 156.00* -23 -10 -29 磺胺醋酰 Sulfacetamide 92.00 -23 -23 -17 甲硝唑 443-48-1 172.00 81.80* -14 -25 -16 Metronidazole 127.70 -14 -15 -26 103-90-2 152.10 110.05* -11 -19 -19 对乙酰氨基酚 Paracetamol 93.10 -11 -25 -15 西布特罗 Cimbuterol 54239-39-3 234.20 143.10* -27 -25 -26 160.10 -24 -15 -29 磺胺嘧啶 Sulfadiazine 68-35-9 251.00 156.00* -30 -15 -29 92.10 -30 -25 -17 咪多卡二丙酸 Imidocarb 55750-06-6 349.15 188.10* -11 -30 -18 盐 dipropionate 162.15 -10 -26 -15 地美硝唑 551-92-8 142.00 96.10* -10 -19 -15 Dimetridazole 95.10 -10 -23 -16 2-Amino-5-prop 133.20* -15 -27 -24 阿苯达唑-2- 氨基砜 80983-34-2 240.30 ylsulphonylbenz imidazole 198.10 -15 -18 -21 吲哚美辛 Indometacin 53-86-1 358.05 139.05* -10 -21 -23 111.05 -13 -50 -18 倍他米松戊酸 Betamethasone 2152-44-5 477.30 355.10* -12 -25 酯 17-valerate 279.10 -29 氯地孕酮乙酸 Chloromadinon 302-22-7 405.05 345.20* -18 酯 e acetate 309.20 -24 -23 230.15* -20 -30 -20 瑞格列奈 Repaglinide 135062-02-1 453.10 162.10 -21 -22 -20 双氯芬酸 Diclofenac 15307-86-5 296.00 214.00* -11 -34 -13 250.00 -11 -14 -10 格列喹酮 Gliquidone 33342-05-1 528.10 403.05* -26 -14 -18 386.05 -20 -22 -17 倍他米松双丙 Betamethasone 5593-20-4 10418-03-8 505.20 319.10* -40 -23 酸酯 dipropionate 279.10 -40 -20 康力龙 Stanozolol 329.20 121.10* -37 107.10 -42 倍氯米松双丙 Beclomethasone 5534-09-8 521.20 503.20* -26 -12 -36 酸酯 dipropionate 319.20 -26 -17 -22 苯菌灵 Benomyl 17804-35-2 291.10 160.05* -20 -30 -20 192.10 -20 -14 -20 三氯苯哒唑 68786-66-3 359.00 343.90* -17 -26 -23 Triclabendazole 171.00 -17 -51 -30 丙酸诺龙 Nandrolone 7207-92-3 331.20 257.20* -15 -16 -26 17-propionate 239.10 -15 -18 -24 注：*表示定量离子对 1.3标准溶液的配制 精密量取牛奶样品5.0 mL，加入5.0 mL5%甲酸乙腈涡旋混匀30s， 加入WondaPak QuEChERS多兽残专用提取包，涡旋混匀30 s，8000 rpm 离心5 min， 取2 mL 上清液转移至 WondaPak QuEChERS 多兽残专用净化包，涡旋混匀30 s，8000 rpm 离心5 min， 取上清液1mL，室温下氮吹至近干，加入10%甲醇水溶液定溶至1mL，超声溶解30s，过0.22um微孔滤膜，得空白基质溶液。 精确称取适量标准品，用甲醇溶解配制成浓度为 500 ng/mL 的152种兽药混合标准品储备液，使用空白基质稀释成浓度为0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL 和 20 ng/mL 的混合标准溶液。 结果与讨论 2.1标准样品的色谱图 混合标准样品的 MRM 色谱图如图1所示。 LCMSMS-341 图1浓度为1 ng/mL标准品的MRM色谱图 2.2线性关系 精密量取牛奶样品 5.0mL， 按1.3提取和净化方法处理后，得到空白基质提取液，使用该基质溶液稀释储备液，配制成不同浓度的标准工作液，按1.2中的分析条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法制作校准曲线，线性方程、线性范围和相关系数见表3。 表3校准曲线参数(线性回归，权重为1/C²) 序号 化合物 校准曲线 线性范围 准确度(%) 相关系 (ng/mL) 数r 羟基甲硝唑 Y=(38184.1)X+(1593.47) 0.2~20 98.4~102.8 0.9998 2 西马特罗 Y=(343478)X+(15713.6) 0.2~20 97.3~102.2 0.9997 特布他林 Y=(469316)X+(6109.74) 0.2~20 95.3~102.6 0.9996 4 磺胺醋酰 Y=(195061)X+(3663.26) 0.2~20 95.4~103.7 0.9993 甲硝唑 Y=(44398.9)X+(1017.30) 0.2~20 95.8~103.4 0.9996 6 对乙酰氨基酚 Y=(420832)X+(1.05577e+006) 0.2~10 90.2~113.0 0.9952 西布特罗 Y=(978373)X+(12927.3) 0.2~20 94.4~103.2 0.9994 8 磺胺嘧啶 Y=(563441)X+(12702.5) 0.2~20 92.0~103.3 0.9989 9 咪多卡二丙酸盐 Y=(382332)X+(2102.66) 0.2~20 92.1~102.1 0.9990 10 地美硝唑 Y=(42378.7)X+(-1232.84) 0.2~20 94.7~111.4 0.9979 11 阿苯达唑-2-氨基砜 Y=(538766)X+(-3587.42) 0.2~20 94.3~105.6 0.9990 12 替硝唑 Y=(280112)X+(8193.34) 0.2~20 90.2~105.4 0.9980 13 盐酸苯乙双胍 Y=(2.36820e+006)X+(31683.7) 0.2~20 96.8~102.3 0.9998 14 吡哌酸 Y=(1.12902e+006)X+(47712.5) 0.2~20 91.5~107.8 0.9984 15 甲砜霉素 Y=(5884.47)X+(-17.4223) 0.2~20 92.7~113.1 0.9969 16 马波沙星 Y=(462933)X+(-2135.57) 0.2~20 95.3~103.5 0.9995 17 5-羟基噻苯哒唑 Y=(451949)X+(21565.6) 0.2~10 91.9~105.3 0.9981 18 磺胺甲基嘧啶 Y=(524903)X+(28708.9) 0.2~10 90.2~106.1 0.9974 124 仲丁威 Y=(820191)X+(11986.9) 0.2~20 98.2~101.8 0.9999 125 诺龙 Y=(284612)X+(2983.08) 0.2~20 96.9~104.7 0.9996 126 萘普生 Y=(87963.7)X+(-2361.21) 0.2~20 96.7~102.4 0.9997 127 吡喹酮 Y=(1.65061e+006)X+(1.34433e+006) 0.2~20 95.8~102.1 0.9997 128 格列波脲 Y=(333135)X+(-4951.52) 0.2~20 95.5~105.2 0.9993 129 双烯雌酚 Y=(58539.5)X+(2936.95) 0.2~20 87.6~110.7 0.9946 130 170-羟基孕酮 Y=(400613)X+(57857.5) 0.2~20 97.2~103.1 0.9997 131 芬苯达唑 Y=(2.88180e+006)X+(150955) 0.2~20 96.4~103.3 0.9997 132 萘丁美酮 Y=(841588)X+(-7792.05) 0.2~20 96.0~102.3 0.9997 133 格列本脲 Y=(1.25189e+006)X+(-46359.0) 0.2~20 93.4~108.7 0.9974 134 保泰松 Y=(339666)X+(-7914.77) 0.2~20 98.0~105.1 0.9996 135 170-甲基睾丸酮 Y=(399533)X+(62417.1) 0.5~20 98.0~102.2 0.9999 136 氯倍他索丙酸酯 Y=(52056.7)X+(1426.74) 0.2~20 94.0~105.5 0.9988 137 氟替卡松丙酸酯 Y=(127111)X+(601.255) 0.2~20 95.6~105.4 0.9994 138 格列美脲 Y=(528607)X+(-30116.9) 0.2~20 91.3~106.4 0.9978 139 甲羟孕酮 Y=(397761)X+(486.900) 0.2~20 98.8~101.7 0.9999 140 苯硫胍 Y=(1.70639e+006)X+(-17555.2) 0.2~20 97.3~101.8 0.9998 141 吲哚美辛 Y=(406373)X+(-14047.6) 0.2~20 94.4~105.8 0.9984 142 倍他米松戊酸酯 Y=(48211.3)X+(-912.436) 0.2~20 96.8~105.8 0.9993 143 氯地孕酮乙酸酯 Y=(104595)X+(-967.106) 0.2~20 96.4~101.8 0.9998 144 瑞格列奈 Y=(4.04196e+006)X+(28429.3) 0.2~20 95.7~102.8 0.9996 145 双氯芬酸 Y=(319635)X+(-14455.9) 0.2~20 89.4~107.5 0.9968 146 倍他米松双丙酸酯 Y=(47839.0)X+(-1300.16) 0.2~20 90.5~105.9 0.9983 147 康力龙 Y=(135716)X+(5536.11) 0.2~20 95.6~102.9 0.9996 148 格列喹酮 Y=(494989)X+(-218000) 1~20 89.9~109.1 0.9947 149 倍氯米松双丙酸酯 Y=(82067.1)X+(3838.81) 0.2~20 86.0~109.2 0.9956 150 苯菌灵 Y=(39371.4)X+(-1429.35) 0.2~20 97.4~104.8 0.9996 151 三氯苯哒唑 Y=(258704)X+(-13033.7) 0.2~10 90.6~113.0 0.9916 152 丙酸诺龙 Y=(258859)X+(-55136.7) 0.5~20 89.6~114.3 0.9915 2.3精密度实验 使用空白基质配制浓度为 1 ng/mL、5 ng/mL 和 10 ng/mL 的混合标准溶液连续6次进样，考察仪器的精密度，结果如表4所示，保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD) 在 0.01~0.62%和0.23~13.76%之间，表明仪器精密度良好。 表2保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 139 甲羟孕酮 0.06 3.51 0.06 2.21 0.01 1.53 140 苯硫胍 0.06 1.40 0.05 2.00 0.01 2.71 141 吲哚美辛 0.06 4.56 0.06 4.94 0.01 2.45 142 倍他米松戊酸酯 0.06 4.16 0.05 5.82 0.01 3.49 143 氯地孕酮乙酸酯 0.06 5.73 0.06 3.90 0.01 2.14 144 瑞格列奈 0.06 1.55 0.06 2.04 0.01 1.90 145 双氯芬酸 0.07 3.49 0.06 5.69 0.01 2.52 146 格列喹酮 0.06 3.53 0.06 8.83 0.01 3.60 147 倍他米松双丙酸酯 0.06 2.41 0.06 4.53 0.01 4.87 148 康力龙 0.06 3.00 0.06 1.35 0.01 1.30 149 倍氯米松双丙酸酯 0.06 5.11 0.06 7.78 0.01 3.42 150 苯菌灵 0.06 8.66 0.05 11.09 0.01 6.95 151 三氯苯哒唑 0.06 4.60 0.06 9.20 0.01 6.61 152 丙酸诺龙 0.06 6.19 0.06 11.35 0.01 7.62 2.4检出限和定量限 对牛奶乃品按照1.3中处理方法得到浓度为 0.1 ng/mL 的加标样品进样分析，通过软件计算得152种兽药的最低检出限(S/N=3)、最低定量限(S/N=10)结果如表5所示。 表5153种兽药的检出限和定量限 序号 化合物名称 定量限 (ng/mL) 检出限(ng/mL) 羟基甲硝唑 0.013 0.004 2 西马特罗 0.070 0.023 3 特布他林 0.049 0.016 4 磺胺醋酰 0.029 0.009 5 甲硝唑 0.014 0.005 6 对乙酰氨基酚 0.002 0.001 7 西布特罗 0.002 0.001 8 磺胺嘧啶 0.002 0.001 9 咪多卡二丙酸盐 0.003 0.001 10 地美硝唑 0.162 0.054 11 阿苯达唑-2-氨基砜 0.018 0.006 12 替硝唑 0.009 0.003 13 盐酸苯乙双胍 0.003 0.001 14 吡哌酸 0.012 0.004 15 甲砜霉素 0.105 0.035 16 马波沙星 0.003 0.001 17 5-羟基噻苯哒唑 0.004 0.001 129 双烯雌酚 0.172 0.057 130 170-羟基孕酮 0.026 0.008 131 芬苯达唑 0.028 0.009 132 萘丁美酮 0.005 0.002 133 格列本脲 0.003 0.001 134 保泰松 0.052 0.017 135 17-0-甲基睾丸酮 0.011 0.004 136 氯倍他索丙酸酯 0.042 0.014 137 氟替卡松丙酸酯 0.020 0.007 138 格列美脲 0.002 0.001 139 甲羟孕酮 0.050 0.017 140 苯硫胍 0.009 0.003 141 吲哚美辛 0.011 0.003 142 倍他米松戊酸酯 0.083 0.027 143 氯地孕酮乙酸酯 0.049 0.016 144 瑞格列奈 0.002 0.001 145 双氯芬酸 0.009 0.003 146 格列喹酮 0.007 0.002 147 倍他米松双丙酸酯 0.069 0.023 148 康力龙 0.107 0.035 149 倍氯米松双丙酸酯 0.140 0.046 150 苯菌灵 0.156 0.051 151 三氯苯哒唑 0.010 0.003 152 丙酸诺龙 0.020 0.007 2.5 基质加标实验 牛奶样品按1.3中前处理方法进行提取和净化，进样检测，所得空白样品色谱图如图2。对5.0 mL空白牛奶样品进行加标，使得加标浓度分别为 1 ng/mL、5 ng/mL 和 10 ng/mL， 按1.3中前处理方法进行提取和净化，每个浓度样品平行3次实验，所得结果如表6所示，1ng/mL 加标浓度的回收率在 40.0~119.57%之间；5 ng/mL 加标浓度的回收率在 44.25~109.6%之间；10 ng/mL 加标浓度的回收率在 41.66~113.69%之间。将三个浓度下所得回收率结果分为三类：回收率小于50%、51~80%之间和81~120%之间，结果如图3，可见，即使在加标浓度为 1 ng/mL时，超过58%的化合物回收率在81~120%之间，仅有5%的化合物回收率小于50%，回收率良好。使用该方法平行处理三份样品的重现性统计结果如图4，可见三个加标浓度下超过 80%的化合物 RSD 在0~10%之间，仅在 1 ng/mL 浓度时 2%的化合物 RSD 大于20%，表明该前处理和检测方法重现性良好。 图2空白样品色谱图 图33牛奶中不同加标浓度回收率结果统计 图4牛奶中不同加标浓度回收率重现性统计 表6加标样品的回收率结果(n=3) 结论 建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050联用测定牛奶中多兽药残留的方法。该方法在16 min 内完成 152种兽药的分析，涉及的兽药种类包括磺胺类、喹诺酮类、四环素类、硝基咪唑类、β-内酰胺类、氯霉素类、激素类、β-受体激动剂类、大环内酯类、苯并咪唑类、糖皮质激素类等22类，所得校准曲线线性良好；低、中、高不同浓度的混合标准溶液平行测试6次，152种兽药的保留时间和峰面积RSD分别在 0.01~0.62%和0.23~13.76%之间，仪器精密度良好；配制加标浓度为1 ng/mL、5 ng/mL 和 10 ng/mL的样品进样检测，加标回收率在40.0~119.57%之间。表明该方法具有分析速度快、重复性好、灵敏度高的特点，可适用于牛奶中多兽药残留同时检测。 田岛津全球应用技术开发支持中心 使用岛津技迩WondaPak QuEChERS兽残专用产品对牛奶样品进行净化，Shim-pack GIST色谱柱进行分离，在16 min内完成152种兽药的分析，涉及的兽药种类包括磺胺类、喹诺酮类、四环素类、硝基咪唑类、β-内酰胺类、氯霉素类、激素类、β-受体激动剂类、大环内酯类、苯并咪唑类、糖皮质激素类等22类。