果汁饮料中丁二酸检测方案(液相色谱柱)

酒石酸 乳酸 《GB 5009.157-2016食品安全国家标准食品有机酸的测定》 《GB 5009.157-2016食品安全国家标准食品有机酸的测定》中规定了对食品中酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、、丁二酸、富马酸和己二酸七种有机酸的测定方法，方法中推荐使用大曹三耀的中等极性色谱柱CAPCELL PAK C18 MG S5； 4.6 mm i.d.×250 mm 进行分析。 5.3 仪器参考条件 5.3.1 酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、丁二酸和富马酸的测定 5.3.1.1 色谱柱：CAPECELL PAK MG S5 Ci8柱，4.6 mm×250 mm，5 um，或同等性能的色谱柱。 5.3.1.2 流动相：用0.1%磷酸溶液-甲醇=97.5+2.5(体积比)比例的流动相等度洗脱10 min，然后用较短的时间梯度让甲醇相达到100%并平衡 5 min，再将流动相调整为0.1%磷酸溶液-甲醇=97.5+2.5(体积比)的比例，平衡5 min。 5.3.1.3 柱温：40℃。 5.3.1.4 进样量：20pL。 5.3.1.5 检测波长：210 nm。 5.3.2 己二酸的测定 5.3.2.1 色谱柱：CAPECELL PAK MG S5 Cis柱，4.6 mm×250 mm，5 m，或同等性能的色谱柱。 5.3.2.2 流动相：0.1%磷酸溶液-甲醇=75+25(体积比)等度洗脱 10 min。 5.3.2.3 柱温：40℃。 5.3.2.4 进样量：20 pL。 5.3.2.5 检测波长：210 nm。 6种有机酸的标准色谱图见图A.1 己二酸的标准色谱图见图A.2. 图A.16种有机酸的标准色谱图 图 A.2己二酸的标准色谱图(50mg/L) 但由于该方法流动相中水相比例较高(有有相比例仅为2.5%)，考虑到保留时间和色谱柱使用寿命等因素，实验室也尝试使用能耐受纯水的CAPCELL PAK C18 AQ色谱井进行分析，并考察了线性及灵敏度，并对实际样品进行了分析，均可得到良好结果。 依据国标方法，将七种有机酸分为两组分别测定。首先对第一组(酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、丁二酸和富马酸)和第二组(己二酸)标准品进行分析，如图1，第一组六种有机酸可得到良好保留与分离， 各组分离度均在3.0以上，保留程度比 MG 色谱柱有所增强，酒石酸保留时间延长至3.7 min；如图2，第二组中己二酸亦可得到良好分析结果。 Minutes 图 1 CAPCELL PAK C18 AQ 色谱柱分析标准工作液所得结果 *注：峰上标数字为分离度。 HPLC Conditions 色谱柱： CAPCELL PAK C18 AQ S5； 4.6 mmi.d.×250 mm (柱号： A6AD 04296) 流动相：A：0.1%磷酸/甲醇=97.5/2.5 B：甲醇 B%0% (0min) ->0%(10min)->100%(10.1min) -> 100% (15min) ->0% (15.1min) 流速： 1.0 mL / min温检 度：40℃ 测： PDA210 nm 进样量：20pL 样品：酒石酸100 pg/mL， 苹果酸、乳酸和柠檬酸各200 ug/mL， 丁二酸 500 pg/mL，富马酸0.5 pg/mL，用水溶解稀释。 图2 CAPCELL PAK C18 AQ 色谱柱分析己二酸标准工作液所得结果 HPLC Conditions 色谱柱： CAPCELL PAK C18 AQ S5； 4.6 mm i.d. ×250 mm (柱号： A6AD 04296) 流动相：0.1%磷酸/甲醇=75/25 流速：1.0mL/min温检 度：40℃ 测： PDA 210 nm 进样量：20pL 样品：己二酸200 pg/mL， 用水溶解稀释。 (1)标准曲线绘制 依据国标方法对标准曲线进行绘制。如图3~9所示，酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、丁二酸、富马酸和己二酸在标曲浓度范围内均得到良好线性，相关系数R?均在0.999以上(见表1)，符合国国中中量线和定量限要求。 图3酒石酸浓度-峰面积标准曲线 图4苹果酸浓度-峰面积标准曲线 图5乳酸浓度-峰面积标准曲线 图6柠檬酸浓度-峰面积标准曲线 丁二酸 图7丁二酸浓度-峰面积标准曲线 图8富马酸浓度-峰面积标准曲线 己二酸 图9己二酸浓度-峰面积标准曲线 表1线性及检出限和定量限详表 Constituents Liner equations r2 liner range/pg.mL-1 LOQ/mg.kg-1 LOD/mg.kg-1 酒石酸 y=7.59E+03x+2.94E+05 0.9992 50-1000 4.03 1.21 苹果酸 y=3.23E+03x+1.42E+05 0.9991 100-2000 12.35 3.70 乳酸 y=2.59E+03x+8.15E+04 0.9993 100-2000 18.52 5.56 柠檬酸 y=4.89E+03x+1.72E+05 0.9991 100-2000 13.33 4.00 丁二酸 y=2.60E+03x+2.31E+05 0.9992 250-5000 26.04 7.81 富马酸 y=1.53E+06x+9.96E+04 0.9998 0.25-5 0.046 0.014 己二酸 y=4.50E+03x+2.65E+03 0.9998 10-200 17.24 (2)实际样品分析 进一步，我们尝试对某厂家果汁饮料样品A进行分析，结果发现能够对成分表中显示添加的柠檬酸进行良好检测，测得柠檬酸含量为 2.18 g/kg；同时，在苹果酸附近发现干扰峰(见图10)。通过观察苹果酸及干扰峰Ⅰ的紫外吸收光谱，发现干扰峰|并非苹果酸(见图11-1，11-2)。 Minutes 图10果汁样品A分析结果(G1) HPLC Conditions 色谱柱： CAPCELL PAK C18 AQ S5； 4.6 mm i.d.×250 mm (柱主： A6AD 04296) 流动相：A：0.1%磷酸/甲醇=97.5/2.5 B：甲醇B%0%(0min)->0%(10min) -> 100%(10.1min) ->100% (15min) ->0% (15.1min) 流 速：1.0mL/min 温度：40℃检测： PDA210 nm 进样量： 20pL 样羊品：称取5g样品于25mL量瓶中，加水至刻度摇匀，经0.45 pm 水相滤膜过滤。 图11-1干扰峰1紫外吸收光谱 图11-2苹果酸紫外吸收光谱 为摒除干扰峰影响，尝试将柱温由40℃降至25℃， 并对梯度条件进行优化调整，结果可以看到干扰峰同苹果酸和乳酸得到了有效分离(见图12)。 图12果汁样品A分析结果 (G2) HPLC Conditions 色谱柱： CAPCELL PAK C18 AQ S5； 4.6 mmi.d.×250 mm (柱号： A6AD 04296) 流动相：A：0.1%磷酸 B： 甲醇 流速：1.0 mL/ min温检 度： 40℃ 测： PDA 210 nm 进样量：20pL 样品：称取5g样品于25mL量瓶中，加水至刻度摇匀，经0.45 pm 水相滤膜过滤。 同时，对果汁样品A中的己二酸进行测定，样品中未检出己二酸(见图13)。 Minutes 图13果汁样品A分析结果 HPLC Conditions 色谱柱： CAPCELL PAK C18 AQ S5； 4.6 mm i.d.×250mm (柱号： A6AD 04296) 流动相：0.1%磷酸/甲醇=75/25 流速：1.0mL/ min温检 度：40℃ 测： PDA210nm 进样量：20pL 样 品：称取5g样品于25mL量瓶中，加水至刻度摇匀，经0.45 pm 水相滤膜过滤。 综上实验结果，使用可在纯水相条件下稳定使用的高极性 CAPCELL PAK C18 AQ S5； 4.6 mm i.d.×250mm 色谱柱，能够实实国标 GB 5009.157-2016方法中七种有机酸的良好分析，在标曲浓度范围内可得到良好线性结果，相关系数均在0.999以上；同时对果汁样品A进行分析时，通过调整条件，可实现实际样品中有机酸的良好检出。 LC Application Lab， Sanyofine China No.22， HLS Business Park，14 kechuang Street，Economic Technological Development Zone，Beijing， China 100176 Phone 400 801 3103 《GB 5009.157-2016 食品安全国家标准食品有机酸的测定》中规定了对食品中酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、丁二酸、富马酸和己二酸七种有机酸的测定方法，方法中推荐使用大曹三耀的中等极性色谱柱CAPCELL PAK C18 MG S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm进行分析。但由于该方法流动相中水相比例较高（有机相比例仅为2.5%），考虑到保留时间和色谱柱使用寿命等因素，实验室也尝试使用能耐受纯水的CAPCELL PAK C18 AQ色谱柱进行分析，并考察了线性及灵敏度，并对实际样品进行了分析，均可得到良好结果。