大鼠血浆中地榆皂苷I和II检测方案(液质联用仪)

SSL-CA14-535Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-303 岛津全球应用技术开发支持中心上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996http：//www.shimadzu.com.cn 高效液相色谱三重四极杆质谱法测定大鼠血浆中地榆皂苷Ⅰ和Ⅱ含量 LCMSMS-303 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050联用测定大鼠血浆中地榆皂苷I和Ⅱ含量的方法。以 C18反相色谱柱为分析柱，乙腈和0.02%乙酸水为流动相，选择电喷雾电离源(ESI)，内标法定量。地榆皂苷Ⅰ和Ⅱ在2~1000 ng/mL 浓度范围内线性良好相关系数在0.998以上，定量限为2.0 ng/mL。方法特异性考察结果表明空白血浆中没有对分析造成明显干扰的物质，并且地榆皂苷和内标物人参皂苷Rg3之间无相互干扰。方法的日内精密度1.86~5.34%(地榆皂苷Ⅰ)， 4.56~6.01%(地榆皂苷II)，日间精密度4.37~8.93%(地榆皂苷I)，4.88~8.47%(地榆皂苷II)，各浓度水平质控样品的准确度在 85.2~114.4%内。两种地榆皂苷和内标的平均回收率均在75%以上，且没有明显的基质效应。生物样本在整个保存、处理和测定过程中稳定性良好，该方法适用于生物样本中地榆皂苷Ⅰ和Ⅱ的测定。 地榆(Sanguisorba officinalis L.) 为传统天然中草药，现代研究表明，地榆中含有多种天然活性物质，主要包括皂苷、鞣质、黄酮、多糖等，部分活性物质已被开发用于抗炎、抗菌、抗肿瘤、止血及增强免疫等。其中，地榆治疗肿瘤患者因放化疗引起的白细胞减少症临床疗效显著。地榆的临床应用现状历史悠久，且疗效显著，目前其皂苷类物质作用在临床的应用受到广泛的关注。地榆皂苷Ⅰ和Ⅱ是地榆中重要的三萜皂苷活性成分，已经被证明具有多种药理活性，如抗癌、抗炎症、抗皮肤老化等作用。且地榆皂苷Ⅰ会在体内代谢生成地榆皂 图1地榆皂苷Ⅰ的结构图 实验部分 苷Ⅱ。地榆皂苷II作为被认为是治疗胃癌、人乳腺癌、2型糖尿病的潜在抗癌剂。由于生物样品基质复杂，传统液相方法定性定量的准确性差，基质干扰严重，因此有必要建立合适准确的地榆皂苷Ⅰ和Ⅱ在血浆中的LC-MS/MS 的检测方法。 本文使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用，建立了一种准确快速测定血浆中地榆皂苷I和地榆皂苷Ⅱ的同时检测方法。该方法简单、快速、灵敏度高，可供相关检测人员参考。 图2地榆皂苷Ⅱ的结构图 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用系统。具体配置为LC-30ADx2(输液泵)， DGU-20A5R(在线脱气机)， SIL-30AC( 自动进样器)， CTO-30AC(柱温箱)， CBM-20A 系统控制器，LCMS-8050三重四极杆质谱仪，LabSolutions Ver. 5.60 色谱工作站。 1.2分析条件 液相条件 分析仪器： LC-30A系统 柱温：30℃ 色谱柱：ThermoHypersil C18 (50x2.1 mm， 5 um) 洗脱方式：梯度洗脱(见表1) 流动相： A：0.02%乙酸水溶液；B：乙腈 进样体积：5uL 流速：0.2mL/min 表1梯度洗脱程序 Time (min) Module Command Value 0.50 Pumps Pump B Conc. 25 4.50 Pumps Pump B Conc. 90 6.00 Pumps Pump B Conc. 90 7.00 Pumps Pump B Conc. 25 10.00 Controller Stop 质谱分析条件 离子源： ESI(-) 雾化气流速：3L/min 接口温度：300℃ 干燥气流速：10L/min DL管温度：250℃ 加热气流速：10 L/min 扫描模式：多反反监测(MRM) MRM参数：见表2 表2地榆皂苷Ⅰ，地榆皂苷Ⅱ和内标(人参皂苷， Rg3)的MRM参数 Analyte Precursor (m/z) Product (m/z) CE (V) Q1 Pre Bias (V) Q3 Pre Bias (V) ZiyuglycosideI 801.60 603.40 33 30 30 Ziyuglycoside ll 603.60 585.40 38 24 28 Rg3(内标) 819.60 621.40 39 30 30 1.3样品制备 1.3.1标准样品和质控样品溶液配制 皂苷对照品的配制：精密称取地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷I各 10.0 mg定溶于10mL甲醇，配制成1.0 mg/mL 储备液。一份储备液用50%甲醇逐级稀释到：2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200.0，500.0和1000.0 ng/mL 的工作曲线；另一份储备液用50%甲醇逐级稀释至5.0 ng/mL， 50 ng/mL 和 500 ng/mL 的控控样品。 内标储备液的配制：精密称取人参皂苷Rg3 10.0 mg， 用10 mL甲醇溶解定容后，配制成1.0 mg/mL 储备液，用50%甲醇稀释至1.0 ug/mL 内标工作液。 1.3.2样品前处理方法 取 0.1 mL大鼠空白血浆，加内标10 uL (1.0ug/mL)， 混匀后加入1 mL正丁醇，振荡2 min， 10，000 g， 离心5min。移取上清液800 uL于离心管中置450℃真空离心浓缩装置中挥干，用200 uL乙腈溶解残渣， 40，000g离心10min， 5 uL 进样，用样品与内标峰面积比进行定量分析。 结果与讨论 2.1标准样品一级质谱图和产物离子扫描质谱图 图11地榆皂苷Ⅰ的一级质谱图 图21地榆皂苷Ⅰ的产物离子扫描图(CE值40V) 图3地榆皂苷Ⅱ的一级质谱图 图44：地榆皂皂Ⅱ的产物离子扫描图(CE值40V) 图55人参皂苷的Rg3一级质谱图 图6人参皂苷Rg3的产物离子扫描图(CE值40V) 2.2方法特异性考察 取6只不同 SD 大鼠的空白血浆各100 uL， 按“血浆样品处理”项处理(内标由等体积乙腈代替)，进样分析得到空白血浆样本色谱图(图7)；另取100 pL空白血浆，配制成含地榆皂苷I(100.0 ng/mL)、地榆皂苷 II(100.0 ng/mL)和内标(20.0 ng/mL)的血浆样本，进样分析得到加样血浆样本色谱图(图8)；取100 pL大鼠给药2h后的血浆样本，进样分析得斤给药后血浆样本色谱图(图9)。在本实验条件下，在地榆皂苷 I(3.094 min)、地榆皂苷II(4.005 min)和内标(4.074 min)的峰区域没有内源性血浆成分或其他杂质干扰，所测得的结果能代表各地榆皂苷的浓度，证明该方法具有专属性。 图7空白血浆色谱图 图8加入工作液100 ng/mL的血浆色谱图 图9 SD大鼠给予200mg/kg地榆总苷1h后血浆色谱图 2.3线性关系和最低定量限的考察 取 100 uL大鼠空白血浆，加入10 uL不同浓度的标准品后，按相应的“血浆样品处理”项处理，采用标准品峰面积与内标峰面积比R对标准品加入量(浓度C)作线性回归(权重系数为 W=1/C)， 得相应的回归方程，线性关系如表3所示。方法定量限为2 ng/mL， 色谱图如下图10所示，在此浓度水平，精密度和准确度均在接受标准内，6次重复分析RSD 分别为 6.30%(地榆皂苷I)、7.34%(地榆皂苷II)，准确度为86.8~109.7%(地榆皂苷I)、87.3~114.7%(地榆皂苷II)， S/N 平均值为11.6(地榆皂苷Ⅰ)和14.7(地榆皂苷II)。 表33大鼠血浆中地榆皂苷Ⅰ和Ⅱ的线性 化合物名称 校准曲线 线性范围 准确度 相关系数 (ng/mL) (%) 地榆皂苷I Y=(0.624821)X+(0.262459) 2~1000 92.1~107.2 0.9986 地榆皂苷Ⅱ Y=(0.064089)X+(0.042219) 2~1000 91.6~108.3 0.9982 图10 2ng/mL血浆基质加标色谱图 2.4基质效应及回收率 回收率考察，三个浓度水平质控样品 LQC、MQC、HQC(每个浓度重复6次)，比较经过样品前处理的质控样品峰面积A和空白基质后加标样品峰面积B，两者的目标化合物面积平均值的比值 A/B 为回收率。 基质效应考察，三个浓度水平质控样品 LQC、MQC、HQC(每个浓度重复6次)，通过比较空白基质后加标样品峰面积B与浓度一致的标准溶液峰面积C，两者的目标化合物面积平均值所得比值B/C 评价基质效应。结果见表4。 表4大鼠血浆中地榆皂苷Ⅰ和I的基质效应及回收率 理论浓度 回收率(%) 基质效应(%) (ng/mL) 地榆皂苷I 地榆皂苷Ⅱ 地榆皂苷Ⅰ 地榆皂苷Ⅱ 5 78.31 77.27 88.25 87.34 50 89.81 80.23 88.11 89.51 500 87.60 89.82 89.76 86.17 2.5准确度和精密度考察 按照“血浆样品处理方法”项下所述方法分别配制含地榆皂苷I和Ⅱ低、中、高三个浓度的标准血浆样本，每个浓度平行制备6份，连续2天分别测定3个分析批，根据每批随行血浆标准曲线，计算各血浆样品中皂苷浓度，考察批内和批间差异。结果如表5所示。 表5大鼠血浆中地榆皂苷Ⅰ和Ⅱ的精密度及准确度 理论浓度 日内精密度 CV% 日间精密度 CV% 准确度% (ng/mL) 地榆皂苷Ⅰ 地榆皂苷Ⅱ 地榆皂苷Ⅰ 地榆皂苷Ⅱ 地榆皂苷Ⅰ 地榆皂苷Ⅱ 5 (LQC) 5.34 6.01 8.93 8.47 85.2~114.4 85.8~112.6 50 (MQC) 2.71 4.82 6.73 7.86 87.7~105.9 88.4~99.1 500 (HQC) 1.86 4.56 4.37 4.88 86.0~101.2 88.0~108.7 2.6稳定性考察 血浆样本室温放置稳定性考察：将低、中、高不同浓度血浆质控样品各6个重复，在室温放置6h，按“血浆样品的处理”项下操作，测定血浆中药物浓度。 提取后样本在自动进样器中稳定性考察：将低、中、高地榆的血浆质控样本提取后各6个重复，甲醇(v/v)溶解后，在自动进样器(4℃)中放置24 h，测定药物浓度。 血浆样本反复冻融稳定性考察：将低、中、高不同浓度血浆质控样品各6个重复，于-20℃冻存24h后，在恒温水浴37℃条件下放置至完全融解后，再将其置于-20℃冷冻，如此反复冻融3次后，按“血浆样本处理”项下方法处理后进样分析，测定血浆中药物浓度。 表6大鼠血浆中地榆皂苷Ⅰ和Ⅱ的稳定性 地榆皂苷I 地榆皂苷Ⅱ 5 ng/mL 50 ng/mL 500ng/mL 5 ng/mL 50 ng/mL 500 ng/mL 室温稳定性 1.36 1.05 -3.07 -4.11 4.77 -4.45 (6h，RE，%) 自动进样器稳定性 -1.14 6.32 4.92 7.09 3.53 -1.67 (24 h；RE，%) 冻融稳定性 -4.07 7.05 1.64 7.72 2.43 1.41 (3循环；RE%) 计算测定结果平均值同真实浓度间的相对误差(RE，%)，结果见表6所示。室温下6h地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷I的相对误差均处于±5%范围内。自动进样器24h稳定性中，地榆皂苷Ⅰ相对误差绝对值低于6.32%，地榆皂苷I相对误差绝对值低于7.09%。三循环冻融稳定性，地榆皂苷Ⅰ相对误差绝对值低于7.05%，地榆皂苷Ⅱ相对误差绝对值低于7.72%。以上结果表明样品在保存、处理和测定过程中稳定性良好。 2.7 Carryover 考察 考察系统残留的影响，完成浓度最高点分析后，其后分析空白样品中地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ的峰面积。空白样品中地榆皂苷Ⅰ的通道残留量为最低定量限的的6.72%(<20%)且为内标峰面积的1.47%(<5%)，故该通道的残留不影响地榆皂苷Ⅰ的准确定量；地榆皂苷Ⅱ及内标物人参皂苷Rg3的通道中均没有明显的目标化合物色谱峰，色谱图见下图11和图12所示。 图11高高浓度样品后分析后空白样品的MRM色谱图 图12低浓度(2ng/mL)标准样品的MRM色谱图 结论 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用测定血浆中地榆皂苷I和地榆皂苷Ⅱ的方法。该方法在10.0 min 内完成血浆中地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ的检测，采用人参皂苷Rg3为内标定量，方法定量限2 ng/mL， 线性范围为2~1000 ng/mL，相关系数均大于0.998。方法特异性考察结果表明空白血浆中没有对分析造成明显干扰的物质，并且地榆皂苷和内标物人参皂苷Rg3 之间无相互干扰。方法的日内精密度1.86~5.34%(地榆皂苷I)，4.56~6.01%(地榆皂苷Ⅱ)，日间精密度4.37~8.93%(地榆皂苷I)， 4.88~8.47%(地榆皂苷II)，各浓度水平质控样品的准确度在 85.2~114.4%范围，能够满足血浆中药物浓度准确定量的要求。两种地榆皂苷和内标的平均回收率均在75%以上，没有明显的基质效应。高浓度样品分析后考察空白样品中的残留，结果表明在2~1000 ng/mL线性范围内，地榆皂苷Ⅰ的通道残留量为最低定量限的的6.72%(<20%)且为内标峰面积的1.47%(<5%)，该通道的残留不影响地榆皂苷Ⅰ的准确定量；地榆皂苷Ⅱ及内标物人参皂苷Rg3 的通道中均没有明显的目标化合物色谱峰系统残留。生物样本在整个保存、处理和测定过程中都稳定性良好，该方法适用于生物样本中地榆皂苷Ⅰ和Ⅱ的测定。 采用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用测定血浆中地榆皂苷I和地榆皂苷II的方法。该方法采用人参皂苷Rg3为内标定量，方法定量限2 ng/mL，线性范围为2-1000 ng/mL，相关系数均大于0.998。方法的日内精密度1.86~5.34%(地榆皂苷I), 4.56~6.01%(地榆皂苷II)，日间精密度4.37~8.93%(地榆皂苷I), 4.88~8.47%(地榆皂苷II)。两种地榆皂苷和内标的平均回收率均在75%以上，没有明显的基质效应。生物样本在整个保存、处理和测定过程中都稳定性良好，该方法可准确定量生物样本中地榆皂苷I和II。