盐酸多西环素中β-多西环 素检测方案(液相色谱柱)

引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 2D-LC-IT-TOF 杂质鉴定系统定性检测盐酸多西环素片中的药物杂质 摘要：本文建立了使用2D-LC-IT-TOF杂质鉴定系统定性检测盐酸多西环素药物中杂质A(β-多西环素)、杂质B(美他环素)、杂质E(土霉素)和杂质C(4-表多西环素)的方法。该方法使用药典的方法对药物主成分和杂质进行了分离，并通过LCMS-IT-TOF在线对目标杂质进行MS"定性分析。在该例中杂质A和杂质C的分子量相同，多级质谱碎片也几乎一样，如果分析条件改变，出峰顺序也可能发生变化，从而无法对两者准确定性。该系统由于无需条件转换，直接使用药典的方法，因此可以进行准确定性，从而大大节省了方法开发人员的时间。 关键词： 盐酸多西环素杂质 2D-LC-IT-TOF杂质鉴定系统 盐酸多西环素(Doxycycline Hyclate)是以土霉素为原料制得的半合成广谱四环类抗生素，其含半分子乙醇和半分子结晶水的盐酸盐在临床上有着广泛的应用。2010年《中国药典》检测用流动相为醋酸盐缓冲液(0.25mol/L 醋酸铵-0.1mol/L乙二胺四醋酸二钠-三乙胺)，含有离子对试剂乙二胺四醋酸二钠，该方法不能直接使用 MS 进行检测。而更换流动相即费时费力又有可能因为保留时间的改变而丢掉一些未知杂质。本文使用2D-LC-IT-TOF杂质鉴定系统，在不改变流动相的条件下定性检测了盐酸多西环素药物中的4个杂质。供相关人员参考。 1.实验部分 1.1仪器 1.2分析条件 液相色谱条件 柱 温：：335℃ 色谱柱：InertSustainTM C18， 4.6 mm I.D. x150 mm， 5 um 流动相：A-醋酸盐缓冲缓[0.25mol/L醋酸铵-0.1mol/L EDTA 钠盐-三乙胺(100：10：1流动相B-乙腈 A/B=85/15(v/v) 进样体积：20uL检测波长：280nm色谱柱： InertSustainTM C18， 2.1 mm I.D.×50mm，2 um 流动相：A相-0.1%甲酸-水溶液 流 速：1 mL/min B 相-0.1%甲酸-乙腈 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：4006165163 检测波长：280nm 碰撞气：氩气脱溶剂管温度：200℃加热模块温度：200℃校准方法：自动调谐优化电压，外标法校准质量数 时间程序：见表1(2 min 后阀切换流路进质谱)质谱条件 表1.二维梯度洗脱时间程序 分析仪器： LCMS-IT-TOF离子源： ESI离子源接口电压： ESI(+)， 4.5kV；ESI(-)， -3.5kV； 检测器电压：：：1.6kV 时间 B浓度 0.01 10 8.00 50 10.00 50 10.10 10 15.00 Stop 雾化气：氮气1.5 L/min干燥气：氮气10L/min 1.3系统流路图示意图 图1.2D-LC-IT-TOF 的系统流路图 1.4样品制备 (1)将对照品配成1 mg/L溶液，使用质谱探索裂解规律。对照品信息见表2。 (2)按照药典配制一定浓度混标及待测样品溶液，使用二维杂质鉴定系统进行杂质定性。 表2.多西环素及可能的杂质信息 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 名称 多西环素 杂质A 杂质B 杂质C* 杂质E 杂质F 分子式 C22H24N2O； C22H24N20： C22H22N20； C22H24N20； C22H24N20g C23H25NO； 分子量 444.4 444.4 442.4 444.4 460.4 443.4 *除杂质C外，其他均有标准品 2结果讨论 2.1对照品分析 不接色谱柱，对对照品单标进行多级质谱分析，了解其多级裂解规律。 2.1.1盐酸多西环素质谱分析 MS MS²前体离子 m/z 445.1601 Inten.(x1，000，000) 7.5- 428.1355 5.0- 2.5- 446.1633 0.0- 100 150 200 250 400 450 m/z MS’前体离子 m/z 428.1355 MS+前体离子 m/z 321.0755 MS'前体离子 m/z267.0636 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 11Inten.(x10，000) 7.5 252.0410 5.0 2.5- 0.0- -TT 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z 图2.盐酸多西环素的五级质谱图及一级质谱分子式预测结果 对一级质谱进行预测，假设元素组成C、H、O、N，质量数偏差5 ppm， 采用氢碳比，氮规则及多级质谱信息，预测分子式为 C22H24N2O8，多西环素分子式相一致，质量数偏差为-0.90 ppm。根据多级质谱信息推测可能的多级质谱裂解规律如下所示： m/z 267.0636 图3.多西环素可能的质谱裂解规律 2.1.2杂质A质谱分析 MS MS4前体离子 321.0760 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 MS前体离子 267.0638 Inten. (x10，000) 5.0 252.0410 4.0- 3.0- 2.0- 1.0- 0.0- 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z dy 9：18 图4.杂质A的五级质谱图及一级质谱分子式预测结果 对一级质谱进行预测，假设元素组成C、H、O、N，质量数偏差5 ppm，采用氢碳比，氮规则及多级质谱信息，预测分子式为C22H24N2Og，与杂质A相一致质量数偏差为-1.57 ppm，根据多级质谱信息推倒其可能的质谱裂解规律如下： 引领分析科技尽在北京谱明-企业QQ：40061 65163 图5.杂质A可能的结构式及质谱裂解规律 2.1.3杂质B质谱分析 MS 7sInten. (x1，000，000) 443.1444 5.0- 2.5 156.1381 279.1568 426.1184 0.0- 3340451 50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z MS’前体离子 426.1194 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 MS4前体离子 381.0596 Inten. (x100，000)201.05533.0-2.0-335.05111.0- MS’前体离子 201.0553 图6.杂质B的五级质谱图及一级质谱分子式预测结果 对一级质谱进行预测，假设元素组成C、H、O、N，质量数偏差5 ppm， 采用氢碳比，氮规则及多级质谱信息，预测分子式为 C22H22N2O8，与杂质B相一致，质量数偏差为-1.13ppm，根据多级质谱信息推测可能的结构式以及多级质谱裂解规律如下所示： m/z 201.0553 图7.杂质B可能的结构式以及多级质谱裂解规律 2.1.4杂质E 质谱分析 MS MS²前体离子 461.1565 Inten.(x1，000，000 MS+前体离子 426.1193 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 MS’前体离子 337.0710 MS° 前体离子 283.0606 图8.杂质E的六级质谱图及一级质谱分子式预测结果 对一级质谱进行预测，假设元素组成C、H、O、N，质量数偏差5 ppm， 采用氢碳比，氮规则及多级质谱信息，预测分子式为 C22H24N2O9，与杂质E相一致，质量数偏差为2.17 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 ppm，根据多级质谱信息推测可能的结构式以及多级质谱裂解规律如下所示： 图9.杂质E可能的结构式以及多级质谱裂解规律 2.1.5杂质F质谱分析 MS MS’前体离子366.1364 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 MS4 前体离子293.0807 Inten.(x100，000) 1.00- 278.0672 0.75- 0.50- 0.25- 0.00- 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z 图10.杂质Ｆ的四级质谱图及一级质谱分子式预测结果 对一级质谱进行预测，假设元素组成C、H、O、N，质量数偏差5 ppm，采用氢碳比，氮规则及多级质谱信息，预测分子式为C23H25NOg，与杂质Ｆ相一致，质量数偏差为 0.23 ppm。根据质谱结果分析其可能的结构式及质谱裂解规律： 图11.杂质F可能的结构式及质谱裂解规律 2.1.6对照品多级质谱信息汇总 表3.对照品多级质谱信息汇总 名称 多西环素 杂质A 杂质B 杂质E 杂质F 分子式 C22H24N20g C22H24N20； C22H22N20： C22H24N209 C23H25NOg MS 445.1601 445.1598 443.1444 461.1565 444.1654 MS- 428.1355 428.1345 426.1194 443.1453 366.1364 MS 321.0755 321.0760 381.0596 426.1193 293.0807 MS4 267.0636 267.0638 201.0553 337.0710 278.0672 MS 252.0410 252.0410 145.0609 283.0606 一 MS6 一- 268.0351 - 2.2 LC 1stD 分析结果 1stD 分析的主要目的为确定目标杂质的保留时间，以便于捕集到 LOOP 环中，用于二维脱盐分析。本次实验 1stD 色谱图如下，主成分和4个杂质均有明显吸收。 图12.盐酸多西环素的一维 UV 色谱图 2.2.1杂质1的分析结果 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 将目标杂质1切换到 loop 1 中， 2D-LC 分析杂质和空白溶剂。二维 UV 色谱图如图13所示。从两者对比可以看出，保留时间为5.705 min 的色谱峰为杂质1。对杂质1进行质谱分析，总离子流图及提取离子流图见图14，杂质1的质质结果 m/z 为445.1609，见图15. 图13.杂质1二维UV色谱图(黑色：杂质；玫红色：空白) 图14.杂质1正离子模式下总离子流图及正离子提取离子流图 MS MS³前体离子 428.1383 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 MS4 前体离子321.0788 Inten.(x100，000) 1.5 267.0663 1.0- 0.5- 293.0852 0.0 150 200 250 300 350 400 450 m/z 图15.杂质1的四级质谱图及一级质谱分子式预测结果 对一级质谱进行预测，假设元素组成C、H、O、N，质量数偏差5 ppm， 采用氢碳比，氮规则及多级质谱信息，预测分子式为 C22H24N208，质量数偏差为-1.57ppm，与主成分多西环素分子式一致，且多级质谱信息几乎一致，杂质1应为主成分多西环素的同分异构体，根据保留时间及出峰先后顺序，并结合相关资料，杂质1可能为主成分的旋光异构体，可能为杂质C。可能的结构及多级质谱结果如下： C16H1004 m/z 267.0663 图16.杂质1的可能的结果及质谱裂解规律 2.2.2杂质2的分析结果 图17.杂质2二维UV色谱图(黑色：杂质；玫红色：空白) 将目标杂质2切换到loop2中，2D-LC分析杂质和空白溶剂。二维 UV 色谱图如图17所示。从两者对比可以看出，保留时间为5.596 min 的色谱峰为杂质2。对杂质2进行质谱分析，总离子流图及提取离子流图见图18，：杂质2的质谱结果 m/z 为443.1450，见图19。 图18.杂质2正离子模式下总离子流图及正离子提取离子流图 MS MS²前体离子 443.1450 Inten. (x100，000) 426.1206 0.0- 100 1150 200 250 300 350 400 450 m/z 图19.杂质2的二级质谱图及一级质谱分子式预测结果 对一级质谱进行预测，假设元素组成C、H、O、N，质量数偏差5 ppm，采用氢碳比，氮规则及多级质谱信息，预测分子式为 C22H22N208，质量数偏差为0.23 ppm， 与主成分多西环素相比少了两个 H。且其一级、二级质谱与杂质B的一级、二级质谱几乎一致，根据其保留时间、出峰顺序等相关信息，杂质2可能是杂质B。 2.2.3杂质3的分析结果 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 图20.杂质3二维UV色谱图(黑色：杂质；玫红色：空白) 将目标杂质3切换到 loop 3中， 2D-LC分析杂质和空白溶剂。二维 UV 色谱图如图20所示。从两者对比可以看出，保留时间为 5.622 min 的色谱峰为杂质3。对杂质3进行质谱分析，总离子流图及提取离子流图见图21，杂质3的质谱结果 m/z 为 445.1615，见图22。 图21.杂质3正离子模式下总离子流图及提取离子流图 MS MS²前体离子 445.1615 MS前体离子 428.1364 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 Inten.(x100，000) MS4 前体离子321.0786 Inten. (x100，000) 1.5 267.0615 1.0- 0.5- 0.0 150 200 250 300 350 400 450 m/z 图22.杂质3的四级质谱图及一级质谱分子式预测结果 对一级质谱进行预测，假设元素组成C、H、O、N，质量数偏差5 ppm， 采用氢碳比，氮规则及多级质谱信息，预测分子式为 C22H24N2Og， 质量数偏差为2.25 ppm， 与主成分多西环素相分子是一致，但多级质谱结果略有不同，其多级质谱结果与杂质A基本一致，根据其保留时间、出峰顺序等相关信息，杂质3可能是杂质A。 2.2.4已知杂质4的分析结果 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 图23.杂质4二维 UV色谱图(黑色：杂质；玫红色：空白) 将目标杂质4切换到 loop 4中， 2D-LC分析杂质和空白溶剂。二维UV 色谱图如图23所示。从两者对比可以看出，保留时间为5.648 min 的色谱峰为杂质4。对杂质4进行质谱分析，总离子流图及提取离子流图见图24，杂质4的质谱结果 m/z为444.1660，见图25. 图24.杂质4正离子模式下总离子流图及正离子提取离子流图 MS' MS’前体366.1346 引领分析科技尽在北京谱朋-企业QQ：40061 65163 Inten.(x100，000) MS4前体离子293.0811 Inten. (x10，000) 5.0- 278.0535 2.5- 0.0- 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z 图25.杂质4的四级质谱图及一级质谱分子式预测结果 对一级质谱进行预测，假设元素组成C、H、O、N，质量数偏差5 ppm， 采用氢碳比，氮规则及多级质谱信息，预测分子式为 C23H25NOg， 质量数偏差为1.58ppm， 其多级质谱与杂质Ｆ基本一致，根据其保留时间、出峰顺序等相关信息，杂质4可能是杂质F。 2.2.5杂质分析结果汇总 表4.盐酸多西环素中杂质分析结果汇总 杂质 可能的 1stD 2ndD 实测 预测的 理论 质量数 保留时间 保留时间 (min) 偏差 No. 杂质 m/z 分子式 m/z (min) ppm) 杂质 1 杂质C 6.826 5.705 445.1609 C22H24N20g 445.1605 0.90 杂质2 杂质 B 7.516 5.596 443.1454 C22H22N20： 443.1449 0.23 杂质3 杂质A 9.351 5.622 445.1615 C22H24N20； 445.1605 2.25 杂质4 杂质F 14.621 5.648 444.1660 C23H25NO8. 444.1653 0.23 3结论 本文建立了一种使用非用发性缓冲液作为流动相， 2D-LC-IT-TOF 杂质鉴定系统在线定性检测盐酸多西环素药物中4个杂质的方法。该方法由于保留了药典分析所用的流动相，即保证了杂质定性的准确性，又大大节省了方法开发人员的时间。 <LC 1stD>色 谱 柱：InertSustainTM C18, 4.6 mm×150 mm, 5 μm流动相：A-醋酸盐缓冲液[0.25mol/L 醋酸铵-0.1mol/L EDTA 钠盐-三乙胺（100：10：1）]流动相B-乙腈A/B = 85/15 (v/v)流 速：1 mL/min柱 温：35℃进样体积：20 μL检测波长：280 nm<LC 2ndD>色 谱 柱：InertSustainTM C18, 2.1 mm ×50mm, 2μm流动相：A 相-0.1%甲酸-水溶液B 相-0.1%甲酸-乙腈流 速：0.3 mL/min柱 温：35℃进样体积：20 μL（Loop 环体积）检测波长：280 nm时间程序：见表1 (2 min 后阀切换流路进质谱)