水果制品中甲基对硫磷检测方案(气质联用仪)

Helium DB170.01ppm pesticide mixCompound 5 name： MethamidophosCoefficient of Determination： 0.999929Calibration curve： 50124.8 *x^2+69665.9*x+-455.903Response type： External Std， Area 一次检测10皮克的86种农药残留的气质联用方法 袁猛珀金.埃尔默公司，710 Bridgeport Avenue， Shelton， 康乃狄克州，美国Email：Meng.Yuan@perkinelmer.com 肖辉，孙梦寅，赵雅松北京市食品安全监控中心，北京，，100043 1.月前言 为加强北京市食品安全、商品质量控制及奥运会食品安全监督工作，2004年初，北京市工商行政管理局、北京市人民政府食品安全监督协调办公室设立了北京市食品安全监控中心，构建了食品安全信息监测及研究，突发食品安全事件处理，，食品安全风险评估及预警，奥运食品安全监测以及食品安全技术应用及转化的技术平台，为首都的食品安全，商品质量控制工作和领导决策提供了有力的技术支持。 食品中的农药危害健康，为了保证食品的安全，有必要准确的测量农药残留。多数检测农残的标准方法建议用气相色谱和选择性元素检测器，比如FPD和ECD。’但这些检测器不能提供足够多的信息来证明农药是否确实存在，所以很难消除假阳性的检测结果。质谱仪提供了额外的信息， 自动去卷积的软件AMDIS能够消除假阳性. 气质联用是适合检测农残的方法，它提供了足够的选择性， 同时也比液质联用和气相色谱串联质谱联用更便宜。必须小心选择衬管和毛细管色谱柱，我们建议使用去活化衬管(P/NN6502002)和 DB17 MS色谱柱，惰性的衬管和色谱柱能保证检出限到10皮克。 这篇应用文献描述了用气质联用仪检测10皮克农药残留的方法，珀金.埃尔默公司的Clarus600气质联用仪可以一针准确测试10皮克的86种农药。 图1是北京工商局测试农残的仪器。 图1北京工商局的Clarus600气质联用仪 2. 实验 北京工商局的工程师配置了 1mg/mL 的 86种农药混合标准溶液作为储备液， 农药混标中包括菊酯，有机氯，有机磷，氨基甲酸酯四类农药。 表1仪器参数 气相色谱 PerkinElmer Clarus 600 GC 烘箱起始温度 50 ℃ 保持时间1 1 min 升温速度1 25 ℃/min 到150℃ 保持时间2 0 min 升温速度2 3 ℃/min 到200℃ 保持时间3 0 min 升温速度3 8℃/min 到300℃ 保持时间4 5.83 min 平衡时间 0.2 min 色谱柱 DB 17 MS-30 mx250 pm x0.25 pm 进样口 PSSI 进样模式 不分流脉冲进样 进样体积 1pL 进样口温度 280℃ 载气 氦 载气流速 1 mL/min 质谱 PerkinElmer Clarus 600 MS 质量范围 45-500u 溶剂延迟 4 min 扫描时间 0.20 sec 扫描间隔时间 0.02 sec 传输线温度 280℃ 源温 230 ℃ 光电倍增管电压 500V 通道间隔时间 0.01 sec SIM模式 31 SIM 组 SIR 停留时间 0.04 sec 工作站 TurboMass 5.4.2 系统配置： Clarus600气质联用仪； 去活化衬管 (P/N N6502002)； DB17 MS 色谱柱； TurboMass 5.4.2工作站； NIST谱库，其中包括 AMDIS 质谱去卷积软件. 选择离子扫描模式 SIM 为提高灵敏度， 我们使用选择离子扫描方法， 以下是划分离子组的步骤： ● 每种农药选择一个定量离子和两个定性离子。 每一个离子的停留时间是0.04秒。 每一一个通道包括一到三种农药， 三到九个离子。 离子组之间的保留时间相隔为0.2分钟。 中国农业部规定检测的农药，比如甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷等单独占用-一个通道；这些离子的停留时间是0.08秒。 图2是质谱方法 图2质谱方法 配置标准溶液 配置 10pg/mL标准储备溶液： 用乙腈/甲苯(3：1)混合溶液把100pL 的1000pg/mL农药混标稀释到10mL，需冰箱冷冻保存。 配置 0.100pg/mL 工作标准溶液： 用乙腈/甲苯((3：1)混合溶液把100pL 的10pg/mL农药混标稀释到10mL。 表2是具体稀释方法。 表2配置工作曲线农药标准溶液的方法 0.1 pg/mL标准 10 pg/mL标准 乙腈/甲苯 数据点 浓度 溶液体积 溶液体积 (3：1)体积 1 10 pg/L 100pL 0 0.90 mL 2 20 pg/L 200 pL 0 0.80 mL 3 50 pg/L 500 pL 0 0.50 mL 4 100 pg/L 100 pL 0 0 mL 5 200 pg/L 0 20 pL 0.98 mL 6 500 pg/L 0 50pL 0.95mL 7 1000 pg/L 0 100pL 0.90mL 样品制备 QUICK， EASY， CHEAP， EFFECTIVE， RUGGED， AND SAFE (QuEChERS) 方法 把食物样品切成碎块。 50mL 塑料离心管中加入2.00g到10.00g 切碎后的食物样品， 加入 10mL乙腈，加入4g无水 Na2SO4， 0.5g K2HPO4 和0.5g KHzPO4； 涡旋振荡2分钟，高速离心2分钟。 移取1.00mL 上清液到2mL 塑料离心管中，加入200mg 无水 MgSO4和 50mg 伯便胺 Primary Secondary Amine (PSA)； 涡旋振荡2分钟，高速离心2分钟。 QuEChERS 方法可以把样品振荡混匀以后萃取各种农药进入上层的乙腈相，而 PSA 不会吸附农药， 但可以有效去除食物基体提取液中的很多极性干扰化合物， 比如脂肪酸和糖。 日本肯定列表制度方法” 50mL塑料离心管中加入2. 00g 到10.00g切碎后的食物样品， 加入10mL 乙腈， 加入4g无水 Na2SO4， 0.5g K2HPO4 和 0.5g KH2PO4；涡旋振荡2分钟，高速离心 2分钟。 移取1.00mL 到 5.00mL 上清液到 ProElut Carb/NH2 固相萃取小柱(DikmaTechnologies)， 用5mL 乙青/甲苯(3：1)混合溶液清洗小柱。 收集所有的流出液，用氮气吹干，然后加入1.0mL 丙酮/正己烷 (1：1)混合溶液溶解。 由于经处理后的食物样品总是比较脏， 我们不建议使用大体积进样方法，以避免需要经常维护质谱仪离子源。 3. 结果 工作曲线包括7个浓度点， 86种农药中的每一种都要求相对标准偏差少于15%； 如果相对标准偏差大于15%， 就需要重新做工作曲线。 表3中包括600pg的86种农药的相对标准偏差，全部小于15%。 图3是100pg和500pg的农药的总离子色谱图， 条件为不分流进样、进样体积1微升； 这些农药的全扫描定量检出限大约是100pg。 图3100pg(图a)和500pg(图b)农药的总离子色谱图. 计算方法检出限(MDL)可以说明方法的检出能力，定量检出限通常需要方法检出限10倍的浓度。通过公式1来计算方法检出限，先测定空白来决定基线，然后测试8次20 ng/mL 的标准样品来计算方法检出限，每个化合物的方法检出限是通过99%t分布乘以标准偏差计算的，即等于3倍标准偏差。表3给出了每个化合物的方法检出限。 公式1：方法检出限MDL的计算 表3.86种农药的校准表 保留时 定量离 定性离 定性离 相关系 CAS # 名称 间 子 子1 子2 %RSD 数 MDL(pg) 16752-77-5 灭多威 5.323 58 105 88 4.49 0.9998 12.9 2631-40-5 异丙威 5.99 121 136 77 7.49 0.9991 7.5 62-73-7 敌敌畏 6.779 109 185 79 5.53 0.9997 11.5 1563-38-8 克百威 7.159 164 149 131 4.69 0.9993 13.9 10265-92-6 甲胺磷 7.664 94 141 95 5. 93 0.9999 6.3 1918-11-2 芽根灵 9.05 205 220 57 10.93 0.9916 55.0 16655-82-6 3-羟基克白威 10.197 137 180 147 9.01 0.9998 8.7 1129-41-5 速灭威 10.84 108 107 79 8.12 0.9999 6.7 30560-19-1 乙酰甲胺磷 11.261 136 95 94 7.71 0.9999 6.1 63-25-2 甲萘威 11.905 144 116 115 3.53 0.9994 10.4 2631-40-5 异丙威 12.062 121 136 91 7.28 0.9999 7.6 23560-59-0 蚜螨磷 13.213 124 109 89 6.03 0.9999 7.0 3766-81-2 仲丁威 13.472 121 150 91 6.83 0.9999 7.3 13194-48-4 灭线磷 13.697 158 126 97 8.35 0.9998 4.3 114-26-1 残杀威 14.479 110 152 111 8.70 0.9998 7.3 118-74-1 六氯苯 14.88 284 286 282 4.46 0.9999 4.6 298-02-2 甲拌磷 15.252 75 121 97 6.07 0.9999 9.8 12407-86-2 混灭威 15.486 136 121 91 7.06 0.9993 6.9 319-84-6 1-666 15.844 181 219 183 4.05 0.9999 3.7 1113-02-6 氧化乐果 15.901 110 156 79 6.94 0.9999 4.5 82-68-8 五氯硝基苯 17.305 237 249 214 6.00 0.9998 5.0 319-85-7 2-666 18.101 181 219 183 4.28 0.9999 4.2 6923-22-4 久效磷 18.355 127 97 67 8.10 0.9998 1.5 298-04-4 乙拌磷 18.445 88 97 89 6.17 0.9999 8.5 3-666 19.519 181 219 183 3.98 0.9993 3.4 60-51-5 乐果 19.576 87 125 93 5.19 0.9999 5.3 97-17-6 除线磷 19.659 279 223 97 8.01 0.9996 3.6 76-44-8 七氯 19.734 272 274 100 6.38 0.9998 2.9 101-76-8 p，p'-DDM 19.904 201 236 165 9.30 0.9998 4.0 4-666 21.207 181 219 183 4.17 0.9998 3.8 1897-45-6 百菌清 21.378 266 268 264 8.23 0.9999 2.2 23103-98-2 抗蚜威 21.396 166 238 72 7.81 0.9999 3.8 309-00-2 艾试剂 21.504 263 265 66 4.32 0.9998 3.9 5598-13-0 甲基毒死蜱 21.607 286 288 125 6.89 0.9998 5.3 57018-04-9 甲基立枯磷 22.459 265 267 125 6.10 0.9992 6.5 298-00-0 甲基对硫磷 22.522 263 125 209 5.29 0.9999 5.9 29232-93-7 甲基嘧啶磷 22.675 290 305 276 9.27 0.9995 3.5 327-98-0 壤毒磷 22.943 109 297 271 4.53 0.9999 5.0 2921-88-2 毒死蜱 23.321 197 314 199 6.71 0.9998 6.8 121-75-5 马拉硫磷 23.683 173 127 125 7.06 0.9998 5.8 231937-89-6 烯丙菊酯 23.738 123 136 79 购买质谱标准库时，国家科学和技术研究所(NIST)会随标准附送AMDIS软件。AMDIS用于解析重叠的色谱峰，把重叠的质谱图进行去卷积算法，从重叠的色谱峰当中取出目标化合物的干净质谱图，甚至当干扰峰的强度远超过目标化合物的时候， AMDIS也能成功地从色谱柱流失、其他分析物以及共流出的干扰当中分离目标化合物的质谱图。 图4为AMDIS的截屏图片：图a为西红柿的总离子色谱图，图b为保留时间21.31分钟时的266，264，268三个离子碎片的色谱图，图c中黑色的质谱图为21.31分钟的样品峰，而白色的质谱图为NIST谱库中百菌清的标准质谱图，黑色样品质谱图和白色标准质谱图匹配相当好，这就说明西红柿中存在百菌清。 使用QuEChERS和日本肯定列表的方法处理小油菜、西红柿、茶叶和速溶咖啡样品，之后用气质联用仪检测农药残留。图5说明添加800ng/g的农药后，它们的添加回收率和重复的添加回收率。 使用QuEChERS方法处理白菜、梨、大米、玉米粉和面粉样品，之后用气质联用检测农药残留。 图5说明添加300ng/g的农药后，它们的添加回收率和重复的添加回收率；用AMDIS来确证这些食品中检出的农药，避免假阳性检测结果。 图5.86种农药的添加回收率和重复的添加回收率.日本肯定列表的方法处理了小油菜、西红柿、茶叶和速溶咖啡，共688个数据点； QuEChERS方法处理了小油菜、西红柿、茶叶、速溶咖啡、白菜、梨、大米、玉米粉和面粉，共1548个数据点。 大部分农药的添加回收率在70%至130%之间，符合欧盟和美国加州食品农业部的要求。 4. 讨论 本方法突出的特点是灵敏度高。甲胺磷是中国农业部规定检测的农药，通常用气质联用检测甲胺磷难度大；不同的实验室之间用检测甲胺磷来比较他们分析农药药留的方法之好坏。图6是10pg甲胺磷的选择离子扫描的色谱图， 定量离子的信噪比是19， 所以本方法适合检测甲胺磷。Fo 本方法全扫描的灵敏度也高； 图4说明用全扫描检出了西红柿样品中的百菌清，含量是80pg，并且用AMDIS进行了确证。 图6..10pg甲胺磷的选择离子扫描色谱图， 定量离子的信噪比是19。 图7是10pg到1000pg的甲胺磷工作曲线， 由于是2次曲线， 工作曲线至少需要7个点。 图7..10pg到1000pg甲胺磷的工作曲线 推荐用AMDIS来确认复杂基体中的目标化合物， 这样出检测报告的时候会减少假阳性和假阴性， AMDIS能给出更准确的结果。 做样品处理的时候，北京工商局的工程师更喜欢QuEChERS. 因为他们每天要检测上百个样品，而QuEChERS方法处理样品速度快，又容易操作。 本方法改进了一些QuEChERS步骤： 第一步加入4g无水Na2SO4，而不是无水MgSO4。因为无水MgSO4 遇水会放热， 热会分解一些不稳定的农药，比如甲胺磷；同时加入0.5 gK2HPO4和0.5g KH2PO4来控制食物样品的pH值。 QuEChERS方法适合处理相对干净的食物样品，比如白菜、梨、大米、玉米粉和面粉。图8是用QuEChERS处理的白菜、梨、大米、玉米粉和面粉的总离子色谱图， 基线是平的。日本肯定列表的方法更适合处理比较脏的样品， 比如速溶咖啡。用日本肯定列表方法处理样品， 被萃取的食品基体少，所以基线更好(图9)； 但缺点是速度慢很多，而且浪费溶剂。本文的方法能够测量多种食品基体当中很低浓度的多种样品。 图8 QuEChERS处理的大米(图a)、面粉(图b)、玉米(图c)、梨(图d)和白菜(图e)的总离子色谱图。 图9. QuEChERS (图a)和日本肯定列表(图b)处理的速溶咖啡的总离子色谱图.日本肯定列表的方法萃取更少的食品基体，所以处理比较脏样品的时候基线更好. 如果加入石墨化炭黑可以吸收食品中的色素，不过，石墨化炭黑也会吸附部分农药。北京工商局的工程师打算进一步改进QuEChERS方法：加入50mg PSA时，1，打算再加入50mg的石墨化炭黑来去除比较脏的样品里面的色素； 当时实验室里面没有石墨化炭黑， 将来会做实验验证石墨化炭黑的效果。 5. 结论 本应用文献说明珀金.埃尔默公司的Clarus600气质联用仪完全满足检测农药残留的要求，能可靠地一针检测10皮克的86种农药； 同时灵敏度高和精度好， 所有农药的相对标准偏差小15%。表3当中工作曲线的相关系数说明了每一种化合物的工作曲线误差小. 北京市食品安全监控中心的工程师按照QuEChERS和日本肯定列表的方法处理各种食品样品， QuEChERS适合处理相对干净的食物样品；日本肯定列表的方法更适合处理比较脏的样品。本方法能够测量多种食品基体当中很低浓度的多种样品。 5.1方法总结 1.1设置顶空进样器和气质联用仪。 2.按照表1描述设置实验方法。 3.测试一个空白样品，检查系统是否污染。 4.测试7点校准，工作曲线是从10到1000 ng/mL。 5. 计算600 ng/mL的标准农药的相对标准偏差，如果相对标准偏差超过15%需要重新制作工作曲线。 6.测试样品。 7. 每20个样品就需要测试一次实验室控制样品。 8.每天都要做仪器校准，，计算出的校准化合物浓度的误差应该在添加的标准物质浓度的20%以内。 方法的质量控制： 检查方法检出限。 计算相对标准偏差，检查方法的精密度。 QuEChERS 方法 把食物样品切成碎块. 50mL塑料离心管中加入2g到10g切碎后的食物样品，加入10mL乙腈.加入4g无水 Na2SO4，0.5g K2HPO4和0.5g KH2PO4。涡旋振荡2分钟，高速离心2分钟。 移取1.00mL上清液到2mL 塑料离心管中， 加入加入200mg 无水 MgSO4 和 50mg伯白胺 Primary Secondary Amine (PSA)。 涡旋振荡2分钟，高速离心2分钟。 日本肯定列表炭黑/氨基方法 50mL塑料离心管中加入2g到10g切碎后的食物样品，加入10mL乙腈，加入4g无水Na2SO4， 0.5g K2HPO4和 0.5g KH2PO4。 涡旋振荡2分钟，高速离心2分钟。 移取1.00mL 到5.00mL 上清液到 ProElut Carb/NH2 固相萃取小柱(DikmaTechnologies)，用5mL乙腈/甲苯、((3：1)溶液淋洗小柱。 收集所有的流出液，氮气吹干，然后加入1.0mL 丙酮/正己烷(1：1)溶液溶解。 参考文献 Ls“蔬菜和水果中有机磷，有机氯，拟除法虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定”，中国农业部， NY761-2008. 2.“Measuring Volatile Organic Compounds by Headspace Trap GC-MS in the BeijingFood Laboratory"， Meng Yuan， et al， American Laboratory， On-Line Edition， April 2009. 3.“QuEChERS a Mini-Multiresidue Method for the Analysis of Pesticide Residues inLow-Fat Products"， http：//www.quechers.com/ 4.“Multiresidue method for the determination of residues of 251 pesticides in fruits andvegetables by gas chromatography/mass spectrometry and liquid chromatography withfluorescence detection”Fillion， J. et al， J. AOAC Int， 83：698-713(2000)