白术中产地差异检测方案(毛细管电泳仪)

现代中药研究与实践2008年第22卷第1期Research and Practice of Chinese Medic inesS=—299—— 白术高效毛细管电泳指纹图谱的建立和产地差异分析 左 坚，纪从兰 (安徽中医药高等专科学校，安徽芜湖241000) 摘要：目的 建立白术的高效毛细管电泳指纹图谱，分析不同产地白术的差异。方法 采用毛细管区带电泳法，建立色谱图，并采用计算机辅助评价系统，对色谱信息进行比较。进样高度：15 cm；进样时间：5s；缓冲溶液：50mmoL·L 硼砂水溶液；分离电压：22kV；检测波长：200mm。结果 建立了白术的高效毛细管电泳指纹图谱，并初步阐明了不同来源的白术药材的差异。结论 该方法建立的指纹图谱稳定可靠；对白术品质的影响因素中，以人工种植影响最大。 关键词：白术；指纹图谱；毛细管电泳；产地 中图分类号：R324 文献标识码：A 文章编号：1673-6427(2008)01-0029-03 Fingerprint Con struction of A tractylodes m arocepha lafrom D ifference Grow ing Area by HPCE ZUO Jian， JI Cong-lan (Anhui Higher Techno logical School of Chinese Medicine， Wuhu 241000， China) Abstract： Objective To establish the fingerp rint and analyze the difference of A. m arocephala from differenthabitats by HPCE M ethods It was used by capillary zone electrophoresis system with the height is 15 cm， thetime is 5 sec； the buffer condition is 50 mmol·Ldisodium tetraborate， running voltage is 22kV with a detectorat 200 nm. Results The fingeip rint was established by HPCE， and the quality differece of A. m arocep/ 5mdifferent habitats was also shown Conclusion Itwas reliable and stable to be established the fingeip rint.Itwasthe most effect for the artificial culture on the quality of A.1m1 arocephala in the correlation factors Key wrds： 4.m arocephala； fingeiprint； HPCE； habitat 白术 Rhizoma atracty lod is m acrocepepha leae为菊科植物白术的干燥根茎。始载于《神农本草经》，在我国有着悠久的药用历史，具有补脾、益胃、燥湿和中的功效。传统主产于浙江盘安、新昌、嵊县及安徽歙县、黄山、宁国一带。全国20多个省(自治区)多有栽培、少有野生。为建立白术优良品种的规模化种植基地，本文通过建立白术的高效毛细管电泳指纹图谱，对不同产地的白术药材品种质量进行了比较。 1 仪器和材料 高效毛细管电泳色谱仪(北京彩陆科学仪器公司)，开口50pm内径石英毛细管(河北永年)，760CRT紫外可见紫外分光光度计(上海分析仪器公司)， HW2000双通道色谱工作站(上海千谱公司)，超声 洗仪(江苏昆山)。 白术样品(产地自采，经安徽中医药高等专科学校王宁副教授鉴定为菊科植物白术 Rhizoma at ( 收稿日期：2007-09-02 ) ractylodis m acrocepepha leae的干燥根茎，采集来源见表：11)。重蒸馏水，其它试剂均为分析醇。 表1 白术样品来源 Tab. 1 Sample sources of A. marocephala 编号 产地 编号 产地 1 亳州1 6 泾县 2 亳州2 7 历口 3 毫州3 8 杞梓里 4 金门牌 9 浙江1 5 金字牌 10 浙江2 2实验方法和结果 21 色谱条件 采用区带电泳的方式进行分离，选用开口无涂层石英管，分离长度40 cm，以 50mmol·L的硼酸水溶液为缓冲溶液，分离电压 22kV，分离时间10m in，每两次进样间隔以缓冲溶液冲洗 2min， 进样高度 15 cm，进样时间5s. 2.2 样品液制备方法的确定 毛细管电泳的基本基质为水溶液，故提取溶液以水为主。为防止挥发性成分的过分散失，提取过 程选择在常温条件下进行。通过对比，发现超声提取效率优于冷浸法。超声提取20min后，提取液的干燥残留物和紫外吸光度不再变化。最终确定制备方法为：白术样品打成粗粉，取 1g，以重蒸馏水K110mL浸泡 30min，然后超声 20 min，过滤得滤液，再通过微孔滤膜，得样品液。 2.3 测定波长的确定 将上述滤液，在190~800mm波长范围内做全波长扫描，发现最大吸收波长在200nm附近。预设190 nm，200 nm，210 nm，254 nm，365 nm分别进行实际色谱测定，发现200mm时吸收峰数量较多，分离度较好，而245nm和365 mm波长时，仅出现4个较强峰。故确定检测波长为200 mm。 2.4 色谱条件的确定 首先用磷酸氢钠硼酸水溶液作为缓冲溶液.发现前者出峰数目少，且不能很好分离，以氢氧化钠调节无明显改善。然后分别采用25、50、75、100 mmol·L的硼酸水溶液作为缓冲溶液，以50 mmol1L浓度分离效果较好。分离电压较高时，分离效果较好，但峰过于集中，且电流较大，引起明显干扰，最后确定22kV为分离电压。以上述条件分离一个样品，记录色谱信息30min，发现10min内出峰基本完全。为减小进样引起峰形展宽，在保证进样量的情况下，尽量减少进样时间，选择5s；采用常规的高度进样方式。 2.5 方法学考察 2.5.1 稳定性试验 选择样品1，按照“2.2"项下制备样品液，冰箱密封储存备测(由于水提液主要成分含多糖，极易霉变)。分别于 0，2，4，8，12，24h后测定。以总贡献最大的四个峰为评价对象，发现 保留时间和积分面积的RSD均不超过3%，平均值分别为1.11%和1.02%。 2.5.2 精密性试验 选择样品1，制备样品液，连续测定5次，对主要峰面积和保留时间进行计算，发现 RSD值分别介于0.87%~2.03%和1.32%~2.33%之间。 2.5.3 重现性试验 取5份样品1，分别制备样品液并测定，对主要的4个吸收峰的峰面积和保留时间进行计算比较，所得RSD 0. 55%~2.54%和1.02%~2.31%之间 2.6 色谱图的获得和对照指纹图谱的确立 按照上述方法操作，记录10批样品的色谱图。将图谱信息以文本格式导出，再导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A，处理得到对照指纹图谱，见图1. 图1白术药材对照指纹图谱 Fig1 Fingerprint of A. marocephala reference 2. 7 不同产地白术的图谱比较 10个色谱图及最终产生的对照指纹图谱通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统的分析，结果见 表 2. Tab. 2 Com parison of fingerprintA. marocephala from different hab ita ts 产地 毫州2 亳州3 毫州1 金门牌 金字牌 泾县 历口 杞梓里 浙江1 浙江2 对照 亳州2 1.000 0.931 0.926 0.814 0.777 0.738 0.653 0.785 0.904 0.883 0.941 毫州3 0.931 1.000 0.964 0.885 0.796 0.801 0.645 0.832 0.945 0.924 0.976 毫州1 0.926 0.964 1.000 0.889 0.842 0.753 0.678 0.862 0.972 0.882 0.976 金门牌 0.814 0.885 0.889 1.000 0.741 0.670 0.607 0.806 0.910 0.837 0.900 金字牌 0.777 0.796 0.842 0.741 1.000 0.647 0.631 0.748 0.851 0.756 0.849 泾县 0.738 0.801 0.753 0.670 0.647 1.000 0.705 0.857 0.741 0.695 0.836 历口 0.653 0.645 0.678 0.607 0.631 0.705 1.000 0.740 0.700 0.573 0.741 杞梓里 0.785 0.832 0.862 0.806 0.748 0.857 0.740 1.000 0.871 0.719 0.900 浙江1 0.904 0.945 0.972 0.910 0.851 0.741 0.700 0.871 1.000 0.897 0.976 浙江2 0.883 0.924 0.882 0.837 0.756 0.695 0.573 0.719 0.897 1.000 0.920 对照 0.941 0.976 0.976 0.900 0.849 0.836 0.741 0.900 0.976 0.920 1.000 从表2可以看出亳州地区三个品种和浙江地区 且地区内品种之间相似度较高，说明这些地区的规模的二个品种与对照图谱比较接近，对图谱贡献较大， 化种植能够保证药材品质较为均一。在祁门地区的 三个品种(金字牌，金门牌，历口)及泾县，杞梓里的二个品种，同为皖南地区生长的品种，但这五个品种间相互相似度都比较差，说明当地零散的种植生产方式对于稳定的药材品质非常不利。 皖南地区的药材处于半野生状态，从相似度关系看，该地区出产的白术与浙江的品种相似程度相对较高，与亳州的差异较大，说明自然情况下白术的差异性分布具有地域特征。 历口的野生白术与其他各个品种差异都很大，说明野生与家种白术具有较大的内在差异，与文献报道情况相同。但其主要色谱峰的积分面积和峰高都较家种要小，故认定野生品种优于家种，还需要深入探讨。 亳州地区和浙江地区地域距离较远，但从色谱图中却看出两地出产白术非常接接，见图2，说明人工种植中引入的共同点影响明显大于地域性差异。 图2浙江产(A)和亳州产(B)白术指纹图谱比较 Fig 2 Com parison of fingerprint of A. marocephala from Zhejang(A) and Bozhou(B) 通过上述分析，可以得出以下结论：白术的内在差异受到多种因素影响，如野生或家种、地域差异，种 植人工化程度等，其中最为主要的是种植方式的差异。由于目前野生资源极少，而人工种植所采用的种质资源流通性强，造成地域间种质差异很小。所以，控制药材优劣的主要手段是优选种质资源，规范化人工种植。 3 讨论 3.1 目前对于白术的化学成分研究主要集中在亲脂性和挥发性较强的成分中，但随着白术多糖的生理活性的揭示，水溶性成分逐步引起重视。传统的炮制和使用方式决定了主要摄入和有效的成分以水溶性为主，在混合成分助溶作用的影响下，水可以溶解部分亲脂性成分。以水提液进行毛细管指纹图谱研究，可以较为真实地反映白术有效成分和内在品质差异。 3.2 以水溶性为主的成分中，白术缺少明确的指标性成分；而且图谱中峰的分布密集，难以插入合适的内标物质。但通过主要峰的人工校正，可以较为准确地对各峰进行归属、比较。 3.3 高效毛细管电泳色谱法操作简便、快速，不需要大量色谱纯溶剂；且由于样品液没有经过预处理，最大限度保存了能供识别的成分，增强了图谱的特征性，故该方法有推广应用的价值。 ( 参考文献 ) ( [1]1 肖培根.新编中药志(第一卷)[M].北京：化学工业出版社， 2002：323. ) ( [2] 周克瑜，许长照.白术地道药材和栽培品的化学成分对比研究 [J].南京中医药大学学报(自然科学版)，200 0 ，16(2)10 9 - 110. ) 2008海峡两岸 CSNR全国第八届天然药物资源学术研讨会通知(第一轮) 为贯彻党的十七大会议精神，全面落实科学发展观，坚持以人为本，使天然药物资源达到全面、协调、可持续发展，本着"繁荣学术、凝聚力量、引领学科"的办会宗旨，努力实现天然药物资源合理开发利用和社会经济可持续发展的战略，2008海峡两岸 CSNR全国第八届天然药物资源学术研讨会拟定于2008年7月中旬在贵州省贵阳市召开，会期3天。本届学术研讨会由 CSNR天然药物资源专业委员会、中国药材 GAP研究促进会(香港)主办，贵州信邦制药股份有限公司承办，贵州中医学院等协办。现在开始进行学术研讨会报名和学术论文征集工作。 一、主题 加强产学研结合，促进中药资源产业化发展。 ( 二、交流研内容 中药资源调查的新技术、新方法研究进展；中药资源生态及适宜区划研究；中药材 GAP研究与实践；中药材生产基地的规范化建设；中药资源产业区域经济发展与产学研结合的有效模式和机制研究；中药及天然药物资源化学与资源高效利用研究；民族药物资源的研究现状与进展；中药及天然药物资源学科基础研究及学科建设。 ) 三、会议论文征集 会议论文可围绕主题和研讨内容，其内容包括前瞻性综述，学科现状、前沿及展望，系统性研究成果，原创性研究工作等。 ( 四、征文要求 请向会议提供 Word软件录入的论文电子版。并同时提供论文打印稿一份，请打印在A4纸上，上下各空 3cm，左右空 2. 2cm，用激光打印机输出。 ) ( 五、会议时间和地点 具体时间和地点请见第二轮通知。也可登陆 CSNR天然药物资源专业委员会网站(http：//202. 195.210.136)或致电查 询会议通知。 ) ( 六、联系方法 联系地址：江苏省南京仙林大学城仙林大道138号；南京中医药大学药学院 CSNR天然药物资源专业委员会办公室，邮政编码： 210046；电话：025-85811133，025-85811132，02 5 -85811511；传真：025-85811524；联系人：陈丽红、乐巍；电子信箱： tryw2008@126. com ) ◎China Academic Journal Electronic Publishing House. 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