果糖二磷酸钠中含量及有关物质检测方案(离子色谱仪)

2Thermo Fisher Scientific，San Jose， CA USA is ISO Certified.上海SCIENTIFIC 潘广文，叶明立，胡忠阳，钟乃飞赛默飞世尔科技(中国)有限公司 Key words： lon chromatography； fructose diphosphate sodium； IPAD 引言 果糖二磷酸钠注射液是一种治疗低磷酸血症的药物，临床上常用作心肌缺血辅助治疗药。低磷酸血症可在急性情况，如输血、体外循环下进行手术和胃肠外营养时出现，也与一些慢性疾病，如慢性酒精中毒、长期营养不良、慢性呼吸衰竭中碳酸耗竭有关。果糖二磷酸钠注射液在临床中的应用很广泛，但由于其本身的结构特点，果糖二磷酸钠的测定多采用衍生后紫外分光光度法；同时在果糖二磷酸钠的生产过程中可能会引入杂质，其有关物质有磷酸果糖、磷酸葡萄糖和果糖等，这几种杂质都是强极性化合物，而且含量很低，在普通反相色谱和示差检测器中无法检测。有文献报道采用纸电泳法分离苯二胺显色后检测的方法，以及薄层色谱法限量检测2-4，也有文献采用固体复合酶法测定果糖二磷酸钠的含量。这几种方法不仅操作繁琐，且重复性和灵敏度存在问题。 本实验采用离子色谱脉冲安培法分离测定果糖二磷酸钠和3种有关物质，分离度好，灵敏度高，操作简便。建立了一种有效检测果糖二磷酸钠及其有关物质的方法。 测试条件 仪器： ICS-5000色谱仪 (Thermofisher公司)，配四元梯度泵，ED安培检测器， AS-AP自动进样器 柱温：30℃； 淋洗先：NaOH/NaOAc梯度淋洗 流速： 0.4mL/min； 定量环：20uL； 检测方式：脉冲积分安培检测(四电位波形) 样品稀释适当倍数后，经过0.22um尼龙滤膜过滤，取续滤液直接上机分析。 结果和讨论 色谱柱的选择及淋洗液梯度条件优化 果糖二磷酸钠的结构中含有两个磷酸基团，可以采用高效阴离子交换色谱法对其进行分离。同时其有关物质为磷酸果糖、磷酸葡萄糖和果糖，这些结构中均含有羟基，能够在安培检测器上有信号。为了保证色谱峰的分离度和保留时间的合理性，我们选择CarboPac PA 20的糖柱和NaOH/NaOAc梯度淋洗的方式。 在上述色谱条件下几种物质的色谱图如下图(图1)。 图1标准溶液的色谱图 重现性、线性和灵敏度 吸取果糖、磷酸葡萄糖、磷酸果糖和果糖二磷酸质量浓度为1.0mg/L的混合标准溶液，重复进样10次，记录色谱图，它们保留时间的相对标准偏差分别为0.41%、0.57%、0.53%，峰面积的相对标准偏差分别为1.60%、1.14%、11.46%，峰高的相对标准偏差分别为0.54%、0.64%、0.62%，重现性较好。 将标准品定量混合并将标准品溶液稀释得到一浓度系列，对上述系列浓度各测定3次后，取其峰面积的平均值，以峰面积为纵坐标，标准液质量浓度为横坐标建立标准工作曲线，各种物质的线性范围如表1，相关系数都在0.9997~0.9998之间。以信噪比(S/N)为3计算检出限，果糖、磷酸葡萄糖、磷酸果糖和果糖二磷酸的检出限依次为0.010、0.010、0.020和0.10mg/L。 表1方法的线性关系 Table 1 Aggression equation of the ions determined 被测物Analyte 回归方程regression equation 相关系数r 线性范围((mg/L) Linear range 果糖、 y=3.5409x-0.0010 0.9997 0.05~2.00 磷酸葡萄糖 y=3.7780x-0.0365 0.9997 0.05~2.00 磷酸果糖 v=0.8078x-0.0127 0.9998 0.10~2.00 果糖二磷酸 v=0.2035x-0.0150 0.9997 1.00~50.00 Y： peak area； x： mass concentration of analyte， mg/L 表2样品中果糖、磷酸葡萄糖、磷酸果糖含量测定结果 Table 2 Contents of related substance in the samples No. Peak Name 测得的量mg/L 样品中的含量mg/kg 1 果糖 0.050 0.03% 2 磷酸葡萄糖 0.0772 0.04% 3 磷酸果糖 0.8832 0.5% 离子色谱分离脉冲安培检测器测定果糖二磷酸钠及其有关物质果糖、磷酸葡萄糖和磷酸果糖的方法操作简便，重复性好，线性范围内相关性好，准确度高。同时果糖二磷酸和三种有关物质相比灵敏度较低，在进行含量测定时，无需较大稀释倍数，可以减小由于稀释倍数过大引入的误差。该方法可同时进行含量测定和有关物质分析，具有较高的实用价值。 ( 1.吴宗华，薛传德，徐燕琴果糖二磷酸钠辅助治疗冠心病[J]中国新药与临床杂志，1997， (4)：201-203 ) ( 2.李平潮芮祖根刘深广果糖二磷酸钠中6-磷酸果 ) ( 糖及果糖检测方法的研究[J]药物分析杂志1998， 5：318-320 ) ( 3.陈心善，刘云薄层色谱法检测果糖二磷酸钠和游离磷酸盐的研究[]；药物分析杂志；1996， 5 ： 303- 305 ) ( 4. 李琴；张士勇.果糖二磷酸钠片的有关物质研究 [J]；中医药临床杂志；2006，18(4)：406-407 ) ( 5.李薇，楚莉辉，劳瑞珍采用固体复合酶测定果糖二磷酸钠含量的方法研究[J]；药物分析杂志， 2009，10： 1 646-1650 ) thermoscientific.com ( C 2013 T h e rmo Fishe r Scie n tific Inc . Al l ri g hts reserved. All trademarks are the pro p erty of Thermo Fisher Scientific Inc. a nd its s ubsidiaries. Specifications， terms a nd p r icin g are subject to change. Not all products are available in all countries. Please consult your l ocal s ales r epresentative for d e tails. ) 北京 免费服务热线： 上海浦东新金桥路27号6号楼 北京东城区安定门东大街28号 8008105118 邮编：201206 雍和大厦西楼F座7层702-715室 4006505118 电话：021-68654588 邮编：100007 传真：021-64457830 电话：010-84193588 传真：010-88370548