磺达肝葵钠中磺达肝葵钠检测方案(离子色谱仪)

潘广文，叶明立，胡忠阳，钟乃飞赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词：离子色谱；磺达肝葵钠 Key words： lon chromatography； Fondaparinux sodium 引言 磺达肝葵钠(Fondaparinux sodium， 又称Arixtra) 是一种新型的全合成抗凝血药物。它的结构中含5个糖单元，每个糖单元上都结合了磺酸基团，分子量为1728道尔顿。磺达肝葵钠是一种高选择性Xa因子抑制剂，主要通过抗凝血酶(ATⅢ)对Xa的特殊抑制而发挥疗效。在预防下肢深静脉血栓形成和肺栓塞的有效性和安全性方面的研究，已证实它的作用跟低分子肝素相同，或优于低分子肝素。磺达肝葵钠具有生物利用度高，起效快，半衰期长、不良反应少等特点，在临床上常用作手术后抗凝血；以及深度静脉血栓病症，防止血液凝固，抑制血栓形成；也用于治疗疗性冠脉综合征。 磺达肝葵钠具有很强的极性，在常规反相C18柱上几乎没有保留；用离子色谱分析，淋洗液浓度很高无法用电导检测。磺达肝葵钠本身的结构特点使得其定量分析和有关物质检测成为一个难题。本文建立了离子色谱法分离、紫外检测器检测磺达肝葵钠及其有关物质的方法，且干扰少，重现性好。 测试条件 仪器： ICS-5000色谱仪(Thermofisher公司)，配梯度泵， VWD3100紫外检测器，AS自动进样器 色谱柱： CarboPac PA1保护柱(10.0um，50×4 mm， P/N：035391)CarboPac PA1分离柱(10.0pm，250×4mm， P/N： 043096)； 柱温：30℃； 淋洗液： A： DMSO溶液(10pL溶于1.0L去离子水)，B：2mol/LNaCl，梯度淋洗； 流速：：1.0mL/min； 定量环：100pL； 检测方式：紫外波长210nm。 样品前处理 样品经过0.22um尼龙滤膜过滤后，直接上机分析。结果和讨论 色谱柱的选择及淋洗液梯度条件优化 磺达肝葵钠的结构中含有五个糖单元结构，每个糖单元上又结合了多个磺酸根，这两种结构使磺达肝葵钠具有很强的极性，在常规反相C18柱上几乎没有保留；而解离的磺酸根使其在离子交换色谱柱上有所保留，这种保留是用离子色谱分析磺达肝葵钠的前提。同时由于多个磺酸根的存在，磺达肝葵钠所带电荷较多，在离子交换色谱柱上保留很强，需要使用高浓度的盐溶液才能将其从洗脱下来。本实验选用了柱容量适合的CarboPac PA1保护柱和分析柱，低浓度DMSO溶液和2mol/L NaCI溶液梯度淋洗，在所用色谱条件下(如表1)，磺达肝葵钠与其有杂质具有良好的分离度(如图1)。因CI会对不锈钢造成锈蚀，本实验使用的高浓度NaCI淋洗液适合于全peek材质的离子色谱。 图1标准溶液和样品溶液的色谱图 表1梯度淋洗条件 时间/min A/% B/% 0 50 50 5 50 50 25 10 90 30 10 90 35 50 50 50 50 50 淋洗液：为A、B两相梯度淋洗(A为10pL/L DMSO溶液，B为2mol/LNaCl溶液) 离子色谱常用的检测器有电导检测器、紫外检测器、安培检测器等。磺达肝葵钠的结构中有五个糖单元，理论上在安培检测器上有明显响应值应，但结构中磺酸基团大大降低了该化合物在安培检测器上的灵敏度，且高浓度的CI也会导致安培检测器中毒；如果采用电导检测器，高浓度的NaCI溶液使样品的电导信号淹没在淋洗液的高背景中，无法检测到信号。选择紫外检测器的原因有两点：首先，磺酸根基团本身具有较好的末端吸收，磺达肝葵钠是全化学合成的，样品纯度较高，末端基本无吸收，不会造成对磺达肝葵钠的干扰；同时调整DMSO的用量，可以降低由于淋洗液梯度造成的基线漂移。 吸取浓度为5.0mg/L的磺达苷葵钠混合标准溶液，重复进样7次，记录色谱图，它们保留时间的相对标准偏差分别为0.41%，峰面积的相对标准偏差分别为1.60%，峰高的相对标准偏差分别为1.0%，重现性较好。 将标准品定量混合并用标准品溶液稀释得到一浓度系列，对上述系列浓度各测定3次后，取其峰面积的平均值，以峰面积为纵坐标，标准液质量浓度为横坐标建立标准工作曲线，磺达肝葵钠检出限为50mg·L，在250-2000mg·L"浓度范围内，相关系数为0.9993， RSD为3.6%，加标回收率为91%。 结论 离子色谱法分离紫外检测器测定黄达肝葵钠及其有关物质，方法简便、稳定，线性范围内相关性好，准确度高，受其他因素干扰小，具有较高的实用价值。 ( 1. 陈纪林，郭远林中国循环杂志，2011，5：322-324 ) ( 2.吴云，赵兴胜，任志亮，王佳乐内蒙古医学杂志， 2012，44(3)：281-283 ) ( 3. Klaeffling， C.， Piechottka， G.； Daemgen-vonBrevern， G .； Mosch， G.； M ani， H.， Luxembourg，B.，Lindhoff-Last， E. T herapeutic Drug Mo n itoring，2006，28 (3)：375-381 ) ( 4. Paolucci F ， Frasa H， Van A arle F， Capdevla A，Clavies MC， van D inther T， Donat F， Hendriks Y，van d en Heuvel M， N a dal T， Lagrange F， NecciariJ， Perez Y Clinical Laboratry 2003，49(9-10)：451-460 ) ( 5. MJ S a nfelippo， VB Tillema American Society forClinical Pathology. 2009，132，608-612. ) ( 6. Mitsuhiro K inoshita， Naotaka Kakoi， Yu-kiMatsuno，Takao Hayakawa， Kazuaki K a kehi，Biomedical Chromatography， 201 1 ， 25(5)： 588-593 ) thermoscientific.com ( C 2013 T h e rmo Fishe r Scie n tific Inc . Al l ri g hts reserved. All trademarks are the pro p erty of Thermo Fisher Scientific Inc. a nd its s ubsidiaries. Specifications， terms a nd p r icin g are subject to change. Not all products are available in all countries. Please consult your ) local sales representative for details. 上海 北京 免费服务热线：上海浦东新金桥路27号6号楼 北京东城区安定门东大街28号 8008105118邮编：201206 雍和大厦西楼F座7层702-715室 4006505118电话：021-68654588 邮编：100007传真：021-64457830 电话：010-84193588传真：010-88370548 ThermoFisherSCIENTIFIC oThermo Fisher Scientific，San Jose， CA USA is ISO Certified.