霉酚酸酯中降解产物检测方案(液质联用仪)

表1.采用 HRAM 全扫描和数据依赖 MS/MS 鉴定 pH 2.0的溶液和过氧化氢中的降解产物 UHPLC 和高分辨率台式质谱仪联用分析霉酚酸酯的降解产物 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 前言 强制降解实验能揭示各种环境因素对原料药和制剂的影响。它能提供药品安全信息、确定推荐储存条件、保质期和分析方法的特异性。而降解产物的信息能帮助改进化合物或配方的发展。 霉酚酸酯(MMF)的商标名称为骁悉 ( CellCept)，是一种免疫抑制剂和霉酚酸(MPA)的前体药物。MMF 广泛的应用在治疗器官移植排异反应和自体免疫疾病的移植药物中。本研究选择 MMF 作为模型化合物。 本文开发了一种快速可靠的分析霉酚酸酯降解产物的完整工作流程，使用的仪器是赛默飞世尔科技的AccelaMUHPLC系统和台式 Orbitrap QExactiveM质谱仪，数据处理采用 Mass FrontierM软件。霉酚酸酯在热和过氧化物催化下的降解研究的 pH值设定为2.0、3.5、6.0和8.2。采用HRAM 全扫描和数据依赖 MS/MS 在高分辨率和极性切换模式下实现降解产物的快速鉴定。 HRAM MS 和 MS/MS 谱图以及正/负离子模式切换，能可靠完成降解产物的定性和结构鉴定。 实验方法 材料与试剂 霉酚酸酯 API CAS# 128794-94-5购自2A PharmaChem (Lisle，IL)，纯度>98%。 霉酚酸酯降解产物标准品 霉酚酸， CAS# 24280-93-1 Sigma-Aldrich。 霉酚酸酯杂质G， CAS# 224052-51-1， Molcan Corporation，加拿大多伦多 霉酚酸酯杂质 A， CAS# 1322681-36-6，Molcan Corporation，加拿大多伦多 盐酸、乙酸铵、氢氧化钠和过氧化氢购自 Sigma-Aldrich。 样品前处理 ·霉酚酸酯储备液，浓度为 2.5 mg/mL 的乙腈溶液，称取25 mg标准品配制在 10 mL 乙腈中。 ·盐酸(0.01N， pH2)，乙酸铵(5mM， pH6)，氢氧化钠(0.01N， pH8)和过氧化氢(3%， pH8.2)。购买的30%过氧化氢用水稀释10倍后用于酸、碱和氧化研究。用氢氧化铵或乙酸调节强制降解溶液 pH 值。 ( ·用如上 pH 2、pH6、pH8的溶液和过氧化氢(3%， pH8.2)将浓度为2.5 mg/mL 的霉酚酸酯储备液稀释10倍配制浓度为 0.25 mg/mL 的强制降 解 溶液。强制降解溶液放置于 60℃烘箱中 。 在放置的第1、20、48和72小时分别取样，直接进样到 LC/MS 中进行分析。 ) HPLC方法 ( HPLC系统： T hermo Accela 1 250 p ump，Open Accela Autosampler and Accela PDA ) 色谱柱： Thermo Dionex Acclaim 2.1×150柱，2.2 um柱温箱温度：35℃ 流动相：A-0.1%甲酸水溶液 B-含0.1%甲酸的乙腈 C-100mM 甲酸铵的水溶液(pH5) 梯度洗脱：0-0.5 min 保持20%B， 然后在15 min 内线性增加到40%B 流速：500pL/min 进样体积：1pL 质谱方法 质谱仪： Q Exactive 台式高分辨质谱仪，配备 HESI-II 离子源离子化模式：ESI正/负离子切换 全扫描采集： m/z 120-1000 amu，分辨率为70，000(FMHW@m/z 200) MS/MS采集：35，000分辨率下响应强度数据依赖采集HCD 归一化碰撞能量：35%，25%阶梯变化 结果与讨论 I.UHPLC-高分辨率MS快速测定降解产物 采用 UHPLC-高分辨率MS快速分析降解产物。高质量的HRMS 全扫描图谱为测定降解产物的元素组成提供了重要信息，并从随后的数据依赖 MS/MS 获得分子离子的裂解信息。 图1. MMF 在 pH 2.0和60℃条件立反应1、20、48和72小时的总离子流色谱图 图 2. MMF 在 pH2.0、3.5、6.0和8.2条件下，在3%过氧化氢中反应一小时的总离子流色谱图 Parent11.16 图 3. MMF 在 pH8.2和60℃条件下反应1、20、48和72小时的色谱图 Ⅱ.高分辨率 MS/MS 鉴定降解产物的结构 了信息量丰富的碎片，能更轻松地完成降解产物的结具备阶梯式碰撞能量的高分辨高能碰撞解离功能产生 构鉴定 图4.降解产物D11的全扫描和数据依赖MS/MS图谱 (M+H) 图5.降解产物D5的全扫描和数据依赖 MS2 图谱 化合物 峰识别号 分子式 (M+H)计算值 (M+H)测量值 误差 (ppm) 母离子 母离子 C23H3NO， 434.2173 434.2178 1.0 MF酸 D1 C7H2006 321.1333 321.1331 -0.4 内酯 D2 C17H200： 321.1333 321.1331 -0.4 酯 D3 C7H200： 321.1333 321.1331 -0.4 D4 C7H1g0， 319.1176 319.1175 -0.47 ** D5&D15 C7H180 319.1176 319.1175 -0.47 顺式 MMF D6 C23H3NO， 434.2173 434.2175 0.40 D7 C17H170： 349.0918 349.0915 -0.79 醛 D8 CH100 223.0601 223.0602 0.14 D9 C23H3 NO： 450.2122 450.2123 0.8 杂质 G *D10 C23H31NOg 450.2122 450.2123 0.8 **杂质 G *D12 C23H3NO： 450.2122 450.2123 0.8 *D11 C23H31NO， 466.2072 466.2074 0.52 *D13 C14H120 261.0758 261.0757 -0.4 ** D14 C17H180 319.1176 319.1175 -0.47 ** D16 C23HNO，CI 486.1889 486.1896 1.47 **杂质G D17 Cz3HNO 450.2122 450.2126 0.83 *仅出现在过氧化氢中。 **需要 NMR 进一步确认结构。 Ⅲ.极性切换功能全面鉴定降解产物 快速正/负离子切换实验采用在正离子模式下完成一次全扫描，然后进行数据依赖 MS HCD 裂解。随后转换到负离子模式下进行全扫描和数据依赖MS²HCD 裂解。 自动极性切换提供了不同但是互为补充的降解产物的裂解信息。这些独特极性的碎片能帮助确认结构鉴定结果(图6)。 图6.降解产物D3的 HRAM 全扫描和 MS/MS图谱 MMF 图 7.UHPLC-HRAM 鉴定出的降解产物的可能结构 本文研究了霉酚酸酯API 在 pH2.0、3.5、6.0和8.2条件下的热和过氧化氢降解。采用台式高分辨率质谱仪QExactive 与 UHPLC 系统联用快速准确地分析了降解产物，见图1、2和3。 ( ·高分辨率准确质量数测定(HRAM)的全扫描图谱实现 了快速的鉴定-获得降解产物元素组成的关键信息。 ) 。信息量丰富的高能量碰撞解离(HCD) MS/MS图谱有利于准确鉴定降解产物。 ( 。全扫描和 MS/MS 模式下的正/负离子切换模式能全面 鉴定降解产物，如图4和5所示。 ) 。数据分析软件 Mass Frontier 极大的提高了降解产物结构解析的速度和可靠性。 Q Exactive 台式 Orbitrap MS 具有强大的功能，在一体化UHPLC/HR-MS/MS平台上快速高效地完成降解产物分析，从而显著提高了药物研发过程中降解产物的鉴定通量。 ( 1. M . Brandl， D egradation Products o f Mycophenolate Mofetile in Aqueous Solution Drug Development and Industrial Pharmacy， 25(3)，361-365(1999) ) ( 2. FDA Guidance for In d ustry. A n alytical Procedures and Methods Validation (draft guidance)， August 2000. ) ( 3.ICH guidelines Q1A (R2). S tability Testing of New DrugSubstances and Products ( revision 2)， November 2003. ) ThermoFisherSCIENTIFIC 支持手机用户)SCIENTIFIC 本文研究了霉酚酸酯API 在pH 2.0、3.5、6.0 和8.2 条件下的热和过氧化氢降解。采用台式高分辨率质谱仪Q Exactive 与UHPLC 系统联用快速准确地分析了降解产物，● 高分辨率准确质量数测定（HRAM）的全扫描图谱实现了快速的鉴定 – 获得降解产物元素组成的关键信息。● 信息量丰富的高能量碰撞解离（HCD）MS/MS 图谱有利于准确鉴定降解产物。● 全扫描和MS/MS 模式下的正/ 负离子切换模式能全面鉴定降解产物，如图4 和5 所示。● 数据分析软件Mass Frontier 极大的提高了降解产物结构解析的速度和可靠性。Q Exactive 台式Orbitrap MS 具有强大的功能，在一体化UHPLC/HR-MS/MS 平台上快速高效地完成降解产物分析，从而显著提高了药物研发过程中降解产物的鉴定通量。