奶粉中泛酸检测方案

高效液相色谱法测定奶粉中的泛酸 北京东西分析仪器有限公司中心实验室 摘要：本文根据国家标准 GB 5413.17-2010《婴幼儿食品和乳品中泛酸的测定》，建立了利用我公司高效液相色谱 LC-5500 测定奶粉中泛酸的方法：色谱柱： XBP-CI8柱；流动相：甲醇(0.05 mol/L)：：1KH2PO4=20：80；流速 ：1mL/min；进样量：20uL；紫外检测器，波长200 nm。柱温：30℃±1℃。方法在 1.0 pg/mL到12.0pg/mL之间线性良好，线性相关系数r≥0.999，泛酸的回收率在 99.1%~101.0%之间，RSD 值≤2.69%。对客户提供的奶粉样品进行检测发现，泛酸含量均符合要求，有的样品中泛酸含量远高于标示值。 关键词：LC-5500高效液相色谱；；泛酸；奶粉 从奶粉的三聚氰胺事件以来，国家对乳制品企业检测的要求越来越严格。2010年底至2011年初，国家质检总局对全国乳制品企业进行了集中检查。根据客户的需求，和相应的国家标准以及我们公司高效液相色谱的特点，对乳制品中允许和不允许加入的添加剂如三聚氰胺、山梨酸、苯甲酸、烟酸、牛磺酸、泛酸等的检测方法进行了优化。 泛酸又名维生素B3，因广泛存在于自然界故被命名为泛酸。泛酸是由泛解酸和β-丙氨酸组成的一种化合物。泛酸主要生理功能作用是构成辅酶A和酰基载体蛋白，并通过它们在代谢中发挥作用。我国国标(GB10765，6，7-1997)中规定，婴幼儿配方奶粉中泛酸含量不得低于1500pg/100g(质量比)。它是乳及乳制品中的重要营养素之一。 1实验材料与方法 1.1主要仪器 北京东西分析仪器有限公司 五栋大楼A2座6层， 100044 ( East & W est Analytical Instruments， Inc.Building A2， 6th F loor， No.5 Plaza，#9 Che Gong Z huang S t，Western District， Beijing， China，100044 ) 1.1.1 LC 5500 高效液相色谱仪(HPLC)：配有紫外检测器(北京东西分析仪器有限公司). 1.1.2分析天平：感量为0.0001g(赛多利斯) 1.1.3超声波水浴(DS6150 ， Do-Chrom) 1.1.4pH计：精度为0.01(北京屹源电子)。 1.1.5滤膜：0.45 pm。 1.2试剂 1.2.1甲醇：色谱纯。 1.2.2盐酸：分析纯。 1.2.3硫酸锌：分析纯。 1.2.4盐酸(0.1 mol/L)：移取8.3 mL盐酸于1000 mL容量瓶中，用水定容。 1.2.5硫酸锌溶液(15 g/100mL)：称取15g硫酸锌用水溶解并定容至100 mL. 1.2.6磷酸二氢钾溶液(0.05 mol/L)：称取6.8g磷酸二氢钾，用水溶解并定容至1000 mL.用磷酸调节pH值至3.0，用 0.45pm滤膜过滤。 1.2.7泛酸标准储备溶液(1mg/mL)：准确称取泛酸钙 1.087g，加水溶解并定容至1000mL.(泛酸浓度=泛酸钙浓度×0.920) 1.2.8泛酸标准中间液(0.1mg/mL)：吸取标准储备液5mL于50mL容量瓶中，加水定容。临用前配制。 1.2.9泛酸标准工作液的配制：分别准确吸取泛酸标准中间液1.0 mL， 2.0 mL， 4.0 mL ， 8.0mL， 12.0 mL于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，得到浓度分别为1.0 pg/mL ， 2.0ug/mL， 4.0 pg/mL， 8.0 ug/mL， 12.0pg/mL的泛酸标准工作液，临用前配制。 1.3 色谱条件 北京东西分析仪器有限公司 ( East & W est Analytical Instruments， Inc.Building A2， 6th F loor， No. 5 Plaza，#9 Che Gong Z huang S t，Western District， Beijing， China， 100044 ) 色谱柱： XBP-C18反相色谱柱(粒径5 um， 250 mmx4.6mm)。 流动相：取磷酸二氢钾溶液800 mL，取甲醇200 mL， 混匀后经0.45 pm 微孔滤膜过滤。 流速：1.0 mL/min。 检测波长：200 nm。 柱温：30℃±1℃。 进样量：20 pL. 1.4测定方法 1.4.1样品处理 称取混合均匀的固态试样约5g(精确至0.0001g)或液态试样约20g(精确至0.0001g)于150 mL三角瓶中，固体试式加入约30 mL 40℃~50℃温水，振摇溶解后超声萃取20 min。，(若样品中含有淀粉，称取样品后加入淀粉酶约0.2g，固体试样加入约 30 mL40℃~50℃温水振摇溶解，盖上瓶塞，在50℃~60℃条件下酶解30 min。) 1.4.2测定液的制备 试样溶液降至室温后，用0.1 mol/L盐酸调节 pH至4.5±0.1，加入 5mL硫酸锌溶液，充分混合。转入100mL 容量瓶中，用水定容至刻度并充分混匀后，用滤纸过滤。滤液经 0.45 pm滤膜过滤后即为试样待测液。 1.4.3测定 仪器条件设置好后，进标准溶液，根据峰高与浓度绘制标准曲线，据保留时间定性，用外标法定量。 2结果与讨论 2.1流动相对样品分离效果的影响 五栋大楼A2座6层， 100044 ( East & W est Analytical Instruments， Inc.Building A2， 6th F loor， No.5 Plaza，#9 Che Gong Z huang S t，Western District， Beijing， China， 100044 ) 采用了有关资料中介绍的流动相 ，V(甲醇)：V(KH2PO4)为1：9进行试验。结果证明虽然在此条件下标准峰的峰型较好，但保留时间较长，并且样品中泛酸的吸收峰无法与样品中其他他分有效分离，说明在该配比的流动相不能用于测定乳制品中的泛酸。 图一流动相V(甲醇)：V(KH2PO4)为1：9泛酸标准样品谱图 图二流动相V(甲醇)：V(KH2PO4)为1：9泛酸样品谱图 为解决上述问题，加大流动相中有机相的浓度，经过试验，流动相V(甲醇)：V(KH2PO4)为2：8时，泛酸的保留时间合适，在6.8min 左右，并且样品中泛酸的吸收峰与样品中其他组分能够有效的分离，且无溶剂峰的干扰，在此条件下可满足测定乳制品中泛酸含量的要求(在下面所进行的各种试验中全部按该条件进行)。 北京东西分析仪器有限公司 Tel： 010-88393500 五栋大楼A2座6层， 100044 ( Fax： 010-88393506 Web： www.ewai-group.com M icroblog： e.weibo . com/dongxifenxi ) 图三三汤流动相V(甲醇)：V(KH2PO4)为2：8泛酸标准样品谱图 图四流动相V(甲醇)：V(KH2PO4)为2：8泛酸样品谱图 2.2标准曲线的绘制 将泛酸标准工作液夜次进样20pL，根据出蜂的面积与相应的泛酸浓度绘制标准曲线(如图五)。 图五泛酸的标准曲线 图五表明，测定液浓度在1.0 pg/mL 到 12.0pg/mL之间线性良好。线性方程Y=9739.54X-1248.31，相关系数： r=0.99977。 ( T el ： 010-88393500 ) 五栋大楼A2座6层， 100044 ( Fax： 010-88393506 Web： www.ewai-group.com M icroblog： e.weibo . com/dongxifenxi ) 按照试验确定的方法，对检测方法进行了回收率的测定，结果如下表。由表一可知，泛酸的回收率在99.1%~101.0%之间，说明在样品处理和测定过程中，泛酸钙的损失很小，检测方法可以应用于奶粉中泛酸钙的测定。 表一泛酸回收率实验结果 样品 加标量(mg) 理论值(mg) 实测值(mg) 回收率(%) 加标 0.20 0.57 0.573 100.5 1 加标 0.40 0.77 0.778 101.0 2 加标 0.80 1.17 1.159 99.1 3 2.4精密度实验 称取4份样品，处理后分别进行测定，结果见表二。由表二可以看出，本方法测定乳制品中中泛酸具有较好的重现性， RSD 值≤2.69%。并且由所得到的数据可知，所测定的客户提供的奶粉中泛酸的含量均符合要求，并且有的产品中泛酸含量远高于标示值。 表二泛酸精密度实验 测定次数 1 2 3 4 平均值 RSD(%) 泛酸含量 5.0 4.9 4.6 4.8 4.87 2.69 (mg/100g) 3 2 7 5 3结论 经试验得知， LC-5500分析奶粉中泛酸的含量，流动相的比例V(甲醇)：V(KH2PO4)为2：8时，泛酸的保留时间合适，在6.8min 左右，并且样品中泛酸峰与样品中其他组分能够有效的分离，且无溶剂峰的干扰，在此条件下可满足测定乳制品中泛酸含量的要求。 此方法在 1.0 pg/mL到12.0pg/mL之间线性良好，线性相关系数r≥0.999。 此方法泛酸回收率与精密度试验结果较好，回收率在99.1%~101.0%之间 ， RSD 值≤2.69 ( T el ： 010-88393500 ) 综上所述，采用LC-5500 HPLC法测定乳制品中泛酸含量的方法是一较理想的方法。该法操作简便，易于掌握，因此可作为常规检测方法应用。本方法对客户提供的奶粉进行了测定，结果显示，奶粉中泛酸的含量均符合要求，并且有的奶粉中泛酸含量明显高于标示值。 ( East & W est Analytical Instruments， Inc.Building A2， 6th F loor， No.5 Plaza，#9 Che Gong Z huang S t，Western District， Beijing， China， 100044 ) Tel： ax： eb： www.ewai-group.comMicroblog： e.weibo.com/dongxifenxi北京市西城区车公庄大街号 Tel： ax： eb： www.ewai-group.comMicroblog： e.weibo.com/dongxifenxi北京市西城区车公庄大街号栋大楼A座层，