免疫荧光染色方法

免疫荧光染色方法 （一）制片 选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。（二）固定除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。 标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。常用抗原物质的固定方法抗原物质           固定剂 固定条件（min）蛋白质抗原 95%～100%乙醇 室温3～10酶、激素 丙  酮 4℃  30免疫球蛋白 四氯化碳  病    毒 丙酮、四氯化碳、无水乙醇 室温5～10或4℃ 30～60    多糖、细菌等   微火加热，甲醇、10%甲醛、丙酮 室温5～10或4℃30～60类    脂     （异嗜性抗原）  10%甲醛，10%佛茂尔（ForMol） 室温3～10（三）水洗 固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。（四）染色染色分直接染色法与间接染色法。 1． 材料与试剂 （1）荧光抗体，稀释至应用浓度。 （2）0.01Mol/L pH7.4PBS液 （3）9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。 （4）带盖方盘 2．直接染色法 （1）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37℃感做30 min～45min。 （2）PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即3×3ˊ冲洗。 （3）蒸馏水冲洗。 （4）滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。 2． 间接染色法 （1） 检查抗原：①取固定标本，加已知的免疫血清，37℃孵育30min；②以PBS液3×3ˊ冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育30min；④PBS 3×3ˊ冲洗；⑤H2O冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。 （2） 检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定；②滴加相应抗原液（按1﹕100～1﹕500稀释），37℃孵育30min；③PBS液3×3ˊ冲洗；④加荧光抗体，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。（五）结果显示 荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定。 荧光强度的表示方法如下： ＋＋＋ ～ ＋＋＋＋：荧光闪亮，呈明显的亮绿色。 ＋＋ ：荧光明亮，呈黄绿色。 ＋ ：荧光较弱，但清楚可见。 ± ：极弱的可疑荧光。 － ：无荧光。（六）标本保存由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。 保存的方法可采取以下几种：①固定标本片以后低温保存，随用随染；②染色片采取优质封固剂，如特别的荧光封固剂（Fluormount）或碱性优质纯甘油固剂等封固。这些封固剂能防止荧光激发，封固后低温保存；④可以采用拍照保存照片。 荧光原位杂交（FISH）实验步骤 仪器设备     1、 医用微波炉；      2、 水浴锅；      3、 OLYMPUS BX51荧光显微镜；      4、 OLYMPUS DP11数字显微照相机。 FISH试剂     （1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃；      （2）20×SSC（pH7.0）；      （3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成；      （4）25mg/ml蛋白酶K消化液。      （5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。      （6）杂交后洗涤液： 20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。 实验步骤     1、脱蜡：      1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；      2）100％酒精两次，每次2min；      3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。     2、蛋白酶处理:      1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。      2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。      3） ×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。      4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。     3、变性：      1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；      2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；      3）78℃孵育8min；      4） 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；      5）空气干燥。     4、杂交：      1）准备探针；      2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；      3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；      4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。      杂交后的水洗：      5）镊子小心去除盖玻片；      6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；      7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；      8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。      检测：      9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。      10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；      11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。 扩增：      12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；      13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；      14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；      15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；      16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；      17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。     5、细胞核染色：      1）张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；      2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。 PRINS步骤     1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS；     2、用0.2mol/L盐酸处理5min；     3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃ 15min；     4、分别用80％，95％和100％酒精脱水，室温干片；     5、加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，各加200μmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl，引物250ng，Taq DNA聚合酶2U)，加盖片；     6、94℃变性5min后置入65℃湿盒中5min；     7、用0.1×SSC液，65℃洗5min；     8、片于65℃ 10s～20s；用4×SSC-0.1％吐温20液42℃洗5min，2次；     9、经Buffer I液洗后滴加20％羊血清封闭30min；     10、加地高辛抗体复合物(1:500)室温下2h；     11、BufferⅢ液洗5min；     12、用BCIP-NBT显色1h～2h，在镜下控制，终止显色；     13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。 FISH-荧光原位杂交实验（原位杂交） 1. 实验目的 通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。 2. 实验原理 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。 杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。 3. 实验用具及材料 Y染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200mL移液器、20mL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温20。 4. 实验方法及步骤 1）探针及标本的变性 （1）探针变性 将探针在75℃怛温水浴中温育5min，立即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。 （2）标本变性 ①将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。 ②取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。 ③立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5min，然后空气干燥。 2）杂交 将已变性或预退火的DNA探针10mL滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于源潮湿暗盒中37℃要交过夜（约15～17h）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。 3）洗脱 此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。 （1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。 （2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。 （3）在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5min。 （4）在室温下，将玻片标本2×SSC中轻洗一下。 4）杂交信号的放大 （1）在玻片的杂交部位加150mL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。 （2）去掉保鲜膜，再加150mL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育40min。 （3）取出标本，将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5min。 （4）在玻片标本的杂交部位加150mL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育20min。 （5）去掉保鲜膜，加150mL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40min。 （6）取出标本，将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min。 （7）重复步骤（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室温清洗一下。 （8）取出玻片，自然干燥。 （9）取200mL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。 5）封片 可采用不同类型的封片液。如果封片中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。 6）荧光显微镜观察FISH结果 先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光。由于本实验使用的是Y染色体上的特异序列，因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳性，即使在末分裂的细胞中，也可以观察到明显的杂交信号。 附录I   FISH相关溶液的配制 1）20×SSC：175.3g NaCl, 882.g柠檬酸钠，加水至1000mL（用10mol/L NaOH调pH至7.0）。 2）去离子甲酰胺（DF）：将10g混合床离子交换树脂加入100mL甲酰胺中。电磁搅拌30min，用Whatmanl号滤纸过滤。 3）体积分数70%甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL 20×SSC，10mL水。 4）体积分数50%甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL 20×SSC，80mL水。 5）体积分数50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。 6）杂交液：8mL体积分数25%DS， 20mL 20×SSC混合。（或40mL体积分数50%DS，20mL 20×SSC，40mL ddH2O混合）取上述混合液50mL，与5mL DF混合即成。其终浓度为体积分数10% DS 2×SSC，体积分数50% DF。 7） PI/antifade溶液 PI原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100mg/mL，取出1mL，加39mL双蒸水，使终浓度为2.5mg /mL。 Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液，使其浓度为10mg/mL，用0.5mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0。取上述溶液1mL，加9mL甘油，混匀。 PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1：9比例充分混匀，-20℃保存备用。 8）DAPI/antifade溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI储存液，按体积比1:300,以antifade溶液稀释成工作液。 9）封闭液I：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，dd H2O 1mL, Tween 20 5mL混合。 10）封闭液II：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250mL, dd H2O 750mL, Tween 20 5mL混合。 11）荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，dd H2O 3mL, Tween 20 5mL混合。 12）洗脱液：100mL 20×SSC，加水于500mL，加Tween20 500 mL。 13）TE缓冲液：pH8.0: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；                pH7.6: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；                pH7.4: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA。 14）溶液I：25mmol/L Tris HCl(pH 7.4), 10mmol/L EDTA。 15）溶液II：10% SDS，0.2M NaOH。 16）溶液III：Kac 14.7g, HAc 5.8mL, 加水至50mL。 17）LB培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g, NaCl 10g, 加水至1000mL，用5mmol/L NaOH调pH值至7.0。 附录II  DNA探针的制备 质粒DNA克隆的提取、纯化和鉴定。 1）用接种环挑取一小块-70℃冻存的转化菌，接种于5mL LB培养基中，37℃剧烈震荡过夜。 2）将收集到的菌液3000r/min离心10min，弃掉上清液。 3）向菌体沉淀中加入溶液I300mL, 溶液II 350mL，混匀后将其置于冰浴中片刻，再加溶液III 350mL混匀，加酚和氯仿混合液（体积比为1：1）500mL 后充分混匀。 4）12000r/min离心10min。 5）取上清液，向其加入600mL异丙醇，充分混匀后以12000r/min离心15～30min，弃掉上清液。 6）用1500mL体积分数70%乙醇洗涤沉淀2～3次，晾干。 7）用TE缓冲液溶解DNA沉淀。 8）加水至200mL，以Rnase A（终浓度200mg /mL）在50℃水浴中消化30min。 9）加入酚、氯仿和异丙醇（三者体积比25：24：1）溶液200mL混匀，12000r/min离心2min。 10）取上清液，再加入氯仿和异戊醇溶液（体积比为24：1）200mL混匀，12000r/min离心2min。 11）取上清液，以20mL 3M NaAc及500mL体积分数100%乙醇沉淀DNA。 12）可将上述溶液在-70℃放置30min至1h以充分沉淀DNA，然后用12000r/min离心15min。 13）将沉淀用1.5mL体积分数70%乙醇轻洗，自然晾干。 14）用TE缓冲液溶解DNA。 15）取1～2mL上述纯化的DNA溶液，于8.0g/L琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电泳鉴定DNA并检测浓度。 16）取1mg DNA，用相应限制性内切酶4～5单位，BSA100～200mg /mL，于37℃水浴中酶解2～4h。 17）电泳观察，根据酶切片段数量及大小，估计DNA克隆插入片段大小。 附录III   探针的生物素标记 探针的标记可采用PCR或缺口平移法来制备，但多数情况下采用缺口平移法来制备。该过程包括以DNase I在DNA双链上作用产生缺口并以此作为第二反应步骤的作用赳噗，即大肠杆菌聚合酶I自缺口处进行修补合成。在修补合成互补链时将生物素标记的d-NTP掺入，从而复制出带有生物素标记的探针。本实验采用缺口平移法，按GIBCO公司提供的方法以biotin-14-dATP标记探针。标记好的探针可以在-20℃下长期保存。 总反映体积50mL， DNA 1mg,10×dNTP 5mL, 10×Enzyme Mix 5mL。 其中10×dNTP为：500mmol/L Tris·HCl(pH 7.8) 50mmol/L MgCl2 100mmol/Lβ-硫基乙醇 100mg /ml去除核酸酶的牛血清白蛋白 0.2mmol/L dCTP, 0.2mmol/L dGTP, 0.2mmol/L dTTP 0.1mmol/L dATP, 0.1mmol/L biotin-14-dATP 10×酶混合为：                   0.5units/mL DNA聚合酶I                   0.075untis/mL Dnase I                   50mmol/L Tris·HCl(pH 7.5)                   5mmol/L醋酸镁                   1mmol/L β-硫基乙醇                   0.1mmol/L苯甲基磺酰氟                   体积分数50%甘油                   100mg /mL牛血清白蛋白 将上述混合液于16℃作用1h。用8.0g/L琼脂糖/TBE缓冲液凝胶电检测标记产物。以DNA片段长约300～500bp为宜。如片段较大，则应加适量Dnase I继续酶切，直至DNA片段长度适中后，加5mL终止缓冲液（300mmol/L EDTA）终止反应。用乙醇沉淀的方法将探针与非掺入的核苷酸分开。